Ⅰ、小檗堿上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體mRNA表達的信號通路研究Ⅱ、小檗堿類似物Y53在糖尿病小鼠體內(nèi)抗炎、抗氧化和預防糖尿病腎病的作用研究.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　第一部分 小檗堿上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體mRNA表達的信號通路研究
　　我們此前的研究結果顯示天然產(chǎn)物小檗堿(BBR)通過激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑來上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體(LDLR)的mRNA表達從而發(fā)揮降低血清膽固醇(CHO)的作用。但BBR是如何激活ERK的尚不明確。本研究旨在探索BBR激活ERK絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的上游細胞信號通路和信號分子的作用機制。我們

2、在信號通路的阻斷實驗中使用了多種化學抑制劑，如Raf-1特異性抑制劑GW5074、Ras抑制劑手霉素A(manumycinA)、蛋白激酶C(PKC)抑制劑十字孢堿和AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)特異性抑制劑compound C等，也用到了特異性的小干擾RNA(siRNAs)來沉默AMPK的表達;應用western blot來檢測相關蛋白激酶的磷酸化水平;采用實時熒光定量反轉錄PCR(qRT-PCR)來檢測LDLRmRNA的表達水平;以

3、脂肪乳劑灌胃的方法建立了大鼠高血脂模型以研究BBR在體內(nèi)對相關信號通路的作用。體外實驗結果發(fā)現(xiàn)BBR在HL-7702細胞和HepG2細胞中均可以顯著增加Raf-1的絲氨酸388(ser338)的磷酸化水平，這種作用具有時間依賴性和劑量依賴性。BBR對Ras蛋白的活性沒有影響;其激活Raf-1信號通路和上調(diào)LDLRmRNA表達的作用能被GW5074所完全阻斷，但不能被manumycinA所阻斷。動物實驗結果證實BBR在高血脂模型的大鼠體內(nèi)

4、具有激活肝臟Raf-1和上調(diào)肝臟LDLR mRNA表達的作用，但不影響肝臟的Ras活性。更為重要的是，我們的研究結果顯示BBR激活Raf-1信號通路和上調(diào)LDLR mRNA表達的作用能夠被compound C這一特異性的AMPK抑制劑所完全阻斷，同時也能被AMPK siRNA所阻斷。綜上所述，我們的結果首次證明BBR在肝細胞中通過AMPK依賴的方式來激活Raf-1通路從而上調(diào)肝臟LDLR mRNA的表達，該過程與Ras途徑無關。我們的研

5、究進一步闡明了BBR降CHO的分子藥理機制，為其將來在臨床用于治療高CHO血癥提供了新的科學依據(jù)。
　　第二部分 小檗堿類似物Y53在糖尿病小鼠體內(nèi)抗炎、抗氧化和預防糖尿病腎病的作用研究
　　本部分實驗旨在探索化合物假小檗堿(Y53)這一小檗堿(BBR)類似物在糖尿病(DM)小鼠中的抗炎、抗氧化和預防糖尿病腎病(DN)的作用。
　　首先，我們觀察了Y53和BBR對正常小鼠血糖和肝、腎功能的影響。使用昆明(KM)小鼠，以

6、Y53100mg/kg或BBR100mg/kg灌胃給藥30天，觀察動物的一般情況，實驗結束后測定空腹血糖(FBG)、肝功能指標、腎功能指標并進行肝和腎的蘇木精&伊紅(H&E)染色，觀察病理學變化。實驗結果顯示，Y53和BBR給藥后動物一般情況良好，二者在100mg/kg這一劑量給藥時對KM小鼠的FBG、體重和肝、腎功指標均無明顯影響，病理結果也提示Y53和BBR對肝臟和腎臟無明顯毒性。
　　接下來，我們探索了Y53在合并脂肪肝的D

7、M模型小鼠體內(nèi)的抗氧化應激、抗炎和調(diào)節(jié)糖脂代謝的活性與機制。我們采用高脂飲食(HFD)誘導聯(lián)合一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)120mg/kg的方法誘發(fā)C57BL/6J小鼠DM的發(fā)生。此后，造模成功的DM模型小鼠被分為4組，分別每天口服灌胃給予生理鹽水、BBR50mg/kg、Y5350mgkg或是BBR100mg/kg。實驗結果顯示，Y53能夠顯著降低DM小鼠的血脂和FBG，恢復血清胰島素水平和胰腺重量，并顯著上調(diào)肝臟低密度脂蛋白受體

8、(LDLR)和胰島素受體(InsR)的表達。Y53也能夠顯著抑制模型動物肝臟脂肪變性，減少肝臟脂質積聚，降低肝重和肝指數(shù)，恢復肝功能。DM模型組小鼠體內(nèi)存在著明顯的氧化應激和炎癥反應。Y53可顯著上調(diào)DM動物血清、肝臟和胰腺組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性并降低丙二醛(MDA)的水平;另一方面，Y53顯著降低肝臟和胰腺組織中促炎性細胞因子如白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA的表達水平，同時增加核因子E2

9、相關因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化還原酶-1(NQO-1) mRNA的表達水平。Y53在DM小鼠體內(nèi)的抗氧化應激、抗炎和調(diào)節(jié)糖脂代謝的藥效優(yōu)于同劑量的BBR，幾乎與兩倍劑量的BBR藥效相當。
　　在另一批動物實驗中，我們研究了Y53對小鼠DN的預防作用。我們采用一次性腹腔注射STZ120mg/kg的方法誘發(fā)C57BL/6J小鼠的DM模型。之后，DM模型動物被分為4組，每天分別灌胃給予生理鹽水、BBR50m

10、g/kg、Y5350mg/kg或羅格列酮(ROSI)5mg/kg。實驗過程中和結束后，收集實驗動物的尿液、全血、血清和腎臟組織，使用試劑盒檢測相關指標。部分小鼠腎臟用于H&E染色，還使用實時熒光定量反轉錄-PCR(qRT-PCR)的方式檢測腎臟中目的基因的mRNA表達水平。實驗結果顯示，Y53能夠顯著降低DM動物的FBG和糖化血紅蛋白(GHb)，改善實驗動物多食和多尿等DM癥狀。Y53還可以顯著降低血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)

11、、24 h尿蛋白、腎指數(shù)、血清和腎臟組織的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、一氧化氮(NO)、腎臟MDA、膽固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量，并顯著增加腎臟組織SOD的活力。在病理檢測中，Y53可明顯改善DM小鼠腎臟組織的形態(tài)學并抑制腎小球硬化。Y53能夠顯著降低DM小鼠腎臟中促炎性細胞因子的表達水平以及與腎臟纖維化病變相關的基因，如轉化生長因子-β(TGF-β)和smad2的表達水平。本實驗中Y53的腎臟保護藥效明顯強于BBR和RO