金櫻子對實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病抗氧化和抗炎作用機(jī)制研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，是終末期腎功能衰竭(End-stage renal disease，ESRD)和糖尿病(Diabetes mellitus，DM)患者死亡的主要原因。目前研究認(rèn)為氧化應(yīng)激(oxitative stress，OS)是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，是DN防治研究的熱點(diǎn)，其可以與炎癥反應(yīng)相互作用，共同促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展，但其具

2、體機(jī)制目前仍未闡明。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件(Nuclear factor erythroid2-related factor2/antioxidantresponsive element，Nrf2/ARE)信號通路是機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激途徑，Nrf2是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是調(diào)控炎癥基因表達(dá)的樞紐，與Nrf2存在交互作用，

3、共同調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。然而，有關(guān)Nrf2/ARE和NF-κB通路在DN氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用研究鮮有報(bào)道。金櫻子具有明顯的抗氧化和抗炎作用。我們前期研究顯示，金櫻子生藥可明顯改善實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血糖、血脂紊亂，減輕糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷，抑制NF-κB、MCP-1和TNF-α蛋白表達(dá)，對糖尿病大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用。但金櫻子發(fā)揮上述作用的分子機(jī)制尚未闡明。因此，基于Nrf2/ARE、NF-κB信號通路在抗氧化和炎癥調(diào)節(jié)中

4、的重要作用，本研究以氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn)，體外評估金櫻子提取液抗氧化活性基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探討金櫻子提取液通過影響Nrf2/ARE、NF-κB信號通路激活改善糖尿病腎病氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。
　　 [方法]
　　 體外測定金櫻子提取液抗氧化活性;40只SD大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，按65 mg/kg左下腹腔內(nèi)一次性注射STZ制作DM大鼠模型。造模成功后，隨機(jī)分為兩組，即糖尿病腎病模型組（DN組）和金櫻子治療

5、組（DN+RLM組）。同時(shí)，另取20只同齡SD大鼠分成正常對照組（NC組）和金櫻子對照組（NC+RLM組）。DN+RLM組和NC+RLM組每只大鼠按5 g/kg/d金櫻子提取液灌胃服藥，DN組和NC組灌服等體積生理鹽水。定期測定大鼠體重、血糖、胰島素、24小時(shí)尿微量白蛋白和尿量;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，收集血液測定膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、血尿素氮(blood ureanitrog

6、en，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、糖化血紅蛋白(GHb)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)總抗氧化能力（total anti-oxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性以及炎癥因子IL-6、IL-1β、MCP-1濃度;計(jì)算腎臟指數(shù)（腎/體重），測定

7、腎組織ROS和MDA含量、T-AOC和SOD活性以及腎組織IL-6、IL-1β、MCP-1濃度;HE染色、PAS染色及電鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)病理改變;免疫組織化學(xué)、Western blotting、定量real-time PCR(qRT-PCR)檢測各組腎組織Nrf2及其下游信號分子HO-1、γ-GCS，NF-κB信號通路相關(guān)分子及IL-6、IL-1β、MCP-1表達(dá)情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.金櫻子提取液呈劑量依賴

8、性清除羥自由基（-OH）、超氧自由基(O2-)，可抑制大鼠離體肝、腎組織中MDA的生成以及過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血。
　　 2.糖尿病腎病大鼠經(jīng)金櫻子提取液治療后，大鼠血糖、血脂紊亂和腎功能損害明顯得以改善;金櫻子提取液可明顯降低糖尿病腎病大鼠血液和腎組織中IL-6、IL-1β和MCP-1的濃度以及ROS和MDA水平，增強(qiáng)SOD和T-AOC的活性，減輕糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。
　　 3.形態(tài)學(xué)觀

9、察顯示，糖尿病腎病大鼠腎小球體積增大明顯，基底膜明顯增厚或厚薄不均，系膜基質(zhì)增多，足細(xì)胞足突廣泛融合，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性，PAS紅染區(qū)擴(kuò)大;而金櫻子提取液治療后，腎組織上述病變明顯改善，基質(zhì)積聚、沉積減輕和系膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，但尚未恢復(fù)至正常狀態(tài)。
　　 4.Western blot檢測顯示，與正常對照組大鼠相比，DN組大鼠腎組織Nrf2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)并伴隨有Nrf2下游靶分子HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)下調(diào)，DN大鼠經(jīng)金櫻子

10、提取液治療后，大鼠腎組織Nrf2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且伴有Nrf2下游靶分子HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)上調(diào);免疫組化檢測各組大鼠腎組織Nrf2蛋白表達(dá)時(shí)也得到了與Western blot檢測相似的結(jié)果;qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，金櫻子提取液可明顯上調(diào)DN大鼠腎組織HO-1、γ-GCS mRNA表達(dá)。
　　 5.Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠比較，DN組大鼠腎組織NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并伴有IKKβ

11、蛋白表達(dá)上調(diào)和IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)，DN大鼠經(jīng)金櫻子提取液治療后，大鼠腎組織NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且伴有IKKβ蛋白表達(dá)下調(diào)和IκBα蛋白表達(dá)上調(diào);免疫組化檢測各組大鼠腎組織NF-κB p65蛋白表達(dá)時(shí)也得到了與Western blot檢測相似的結(jié)果;qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，金櫻子提取液可明顯下調(diào)DN大鼠腎組織IL-6、IL-1β、MCP-1 mRNA表達(dá)，這與蛋白水平檢測血液和腎臟組織IL-6、IL-1β、MCP-1表達(dá)

12、的結(jié)果相一致。
　　 [結(jié)論]
　　 1.糖尿病腎病存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，可共同促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展，在此過程中，Nrf2/ARE通路和NF-κB通路扮演了重要角色。
　　 2.金櫻子提取液對糖尿病腎病大鼠具有明顯的降糖、降血脂、抗氧化和抗炎作用。
　　 3.金櫻子提取液可激活Nrf2/ARE信號通路上調(diào)抗氧化酶基因HO-1和γ-GCS表達(dá)，改善糖尿病腎病氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩或阻止糖尿病腎病發(fā)