小檗堿對糖尿病腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用以及對大鼠腎臟AGEs-RAGE信號通路的影響.pdf

1、目的：在大鼠體內(nèi)實驗中，觀察小檗堿(Berberine, BBR)對糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎臟生理病理和腎功能生化指標(biāo)的影響，明確BBR對DN大鼠的腎功能及組織病變的改善作用；檢測大鼠腎臟中部分組織細(xì)胞分泌的信號蛋白表達(dá)和相應(yīng)通路的調(diào)節(jié)變化以及由BBR給藥后影響的變化，探究BBR的腎臟保護(hù)作用是通過何種機(jī)制產(chǎn)生的。
　　在體外細(xì)胞實驗中，通過模擬DN條件刺激腎臟腎小球系膜細(xì)胞(Glome

2、rular mesangial cells, GMCs)和足細(xì)胞，進(jìn)而檢測系膜細(xì)胞中AGEs-RAGE(晚期糖基化終末產(chǎn)物，advanced glycation end products, AGEs;晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，receptor of advanced glycation end products, RAGE)信號通路的異常改變和足細(xì)胞與系膜細(xì)胞相互影響的信號通路VEGF-VEGFR2(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，vascular

3、 endothelial growth factor, VEGF;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子Ⅱ型受體，vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2)的調(diào)節(jié)變化，同時觀察BBR給藥以及相應(yīng)刺激劑和阻斷劑給予后的影響作用，進(jìn)一步探討B(tài)BR對DN的腎臟保護(hù)作用以及潛在的分子機(jī)制和重要的分子靶點；為合理開發(fā)利用BBR防治DN提供理論依據(jù)，并且為探索新的治療DN藥物開拓新的研究方向和思路。

4、r>　　方法：DN大鼠模型的制備，采用長周期（4-6周）高糖高脂飼料喂養(yǎng)并聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(STZ, streptozocin,35mg/kg)腹腔注射誘導(dǎo)。于72h后測量DN大鼠空腹血糖值(FBG, fasting blood-glucose)，將FBG≥11.1mmol/L的SD大鼠納入實驗DN模型組。實驗動物分組如下：正常組(Normal group)，DN模型組(DN model group), BBR低劑量組(50mg/k

5、g), BBR中劑量組(100mg/kg), BBR高劑量組(200mg/kg)，二甲雙胍組(200mg/kg)和卡托普利組(15mg/kg)，每組12只大鼠。正常組大鼠喂以正常飼料，模型組和給藥組繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。所有給藥組按大鼠體重計算給藥量，每日一次灌胃給藥(Intragastric administration, i. g)，正常組與模型組按體重給予相同溶劑羧甲基纖維素鈉溶液(Sodium carboxymet

6、hylcellulose, CMC-Na)平行對照灌胃。FBG值每倆周檢測一次，體重每周檢測一次，處死前一天收集24h尿樣用以檢測尿總蛋白(UTP, total urine protein)和尿肌酐(Ucr, urine creatinine)的含量；麻醉后股動脈取血，分離血清檢測血尿素氮(BUN, blood urea nitrogen)，血肌酐(Scr, serum creatinine)和AGEs的含量。取同側(cè)腎臟稱重，制作組織切

7、片進(jìn)行腎臟病理學(xué)檢查，包括HE染色和PAS染色。免疫組化法觀察腎臟皮質(zhì)中AGEs，RAGE，TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子, transforming growth factor-β1)和PKC-β(蛋白激酶C-β，protein kinase C-β)的分布與表達(dá)；Western blot法檢測腎皮質(zhì)中各信號通路蛋白表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA, enzyme-linked immuno sorbent assay)法檢測各組血清

8、中AGEs的表達(dá)水平。
　　體外實驗以腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞為研究對象，首先分離大鼠的系膜細(xì)胞和足細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，建立DN模型細(xì)胞系。利用CCK-8試劑盒檢測BBR對系膜細(xì)胞和足細(xì)胞DN狀態(tài)下的增殖影響。使用ELISA法檢測系膜細(xì)胞分泌AGEs的情況。對于AGEs-RAGE通路的蛋白，首先使用western blot法觀察正常情況，模型情況和不同濃度BBR給藥后以及使用AGEs刺激劑和RAGE阻斷劑（Ab-RAGE抗體

9、）后各信號蛋白的表達(dá)和變化情況；使用激光共聚焦法觀察RAGE蛋白分布，表達(dá)類型和變化情況。對于VEGF-VEGFR2信號通路蛋白，首先使用蛋白芯片檢測DN狀態(tài)下足細(xì)胞分泌，確定關(guān)鍵因子；western bolt法驗證VEGF，激光共聚焦法確定蛋白的分布和表達(dá)情況。CCK-8法確定VEGF對系膜細(xì)胞的適宜刺激濃度，用western bolt法觀察DN狀態(tài)，高糖，VEGF蛋白，足細(xì)胞上清液刺激和給藥情況下的VEGFR2的表達(dá)和磷酸化的表達(dá)；

10、激光共聚焦法檢測p-VEGFR2的分布和表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1. BBR對DN大鼠的體重和空腹血糖的影響
　　與正常組相比，造模成功后的DN大鼠的空腹血糖值顯著升高；各BBR治療組在前四周無明顯的降血糖效果，而在第6到8周中劑量和高劑量的BBR組與DN模型組相比具有明顯的降血糖作用；二甲雙胍組顯著性降低血糖作用從第四周開始。對于體重，僅高劑量BBR組在第8周具有改善作用。
　　2. BBR對DN大鼠的腎功能及生化指標(biāo)

11、的影響
　　與正常組相比，DN模型組的腎重/體重比值，尿總蛋白/尿肌酐比值，血清尿素氮(BUN, blood urea nitrogen)和血肌酐(SCr, serum creatinine)含量均明顯升高。BBR中劑量組和高劑量組，以及陽性藥二甲雙胍組和卡托普利組均能顯著改善腎功能和降低生化指標(biāo)。
　　3. BBR對DN大鼠的腎臟組織病理學(xué)的影響
　　組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的腎臟腎小球明顯肥

12、大，透明樣變化，基底膜明顯增厚，細(xì)胞外基質(zhì)聚集，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的腎小球硬化，纖維化以及伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤。DN大鼠在給予中劑量和高劑量的BBR的治療后，上述病理現(xiàn)象具有明顯改善；陽性藥二甲雙胍組和卡托普利組也具有明顯的減輕病理表現(xiàn)作用。
　　4. BBR對DN大鼠腎臟皮質(zhì)組織中的AGEs、RAGE、p-PKC-β和TGF-β1蛋白的分布與表達(dá)的影響
　　免疫組化法顯示蛋白分布：在DN大鼠的腎組織中，AGEs彌散性的分布在整

13、個腎小球及其周圍；RAGE主要分布在系膜細(xì)胞的胞膜上，少量分散在胞漿中；p-PKC-β在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均有分布，但主要過表達(dá)集中于細(xì)胞質(zhì)中；TGF-β1主要位于細(xì)胞外液和細(xì)胞外基質(zhì)中。免疫組化法檢測蛋白表達(dá)：與正常組相比，DN模型組的大鼠腎臟中以上蛋白的表達(dá)顯著性的升高，而BBR給藥組中，低劑量BBR能夠有效的降低異常蛋白的表達(dá)，中劑量和高劑量的BBR則能夠更加明顯的改善和降低過高的含量。根據(jù)以上結(jié)果，使用western bo

14、lt法進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)各劑量的BBR均可以降低以上蛋白的過表達(dá)。其中，對于TGF-β1低劑量的BBR雖有降低，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義；對于p-PKC-β的影響，中劑量的BBR效果最為明顯；BBR對于所有蛋白的影響，中劑量和高劑量的BBR效果均強(qiáng)于低劑量的BBR。
　　5. BBR對腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞的生長增殖的影響
　　CCK-8細(xì)胞增值實驗結(jié)果顯示，DN狀態(tài)下系膜細(xì)胞過度增殖，而自15μmol/L開始，BBR即具有顯著的抑制

15、系膜細(xì)胞增殖作用。BBR抑制系膜細(xì)胞過度增殖的IC50約為73μmol/L，根據(jù)此結(jié)果，設(shè)定后續(xù)系膜細(xì)胞的給藥濃度為30μmol/L，60μmol/L和90μmol/L。而對于足細(xì)胞，DN狀態(tài)下，足細(xì)胞數(shù)量減少明顯，當(dāng)BBR的濃度為60μmol/L時，足細(xì)胞的吸光度最高，在此濃度及之前，BBR具有顯著保護(hù)足細(xì)胞的作用；此后隨濃度增高，吸光度逐漸降低，推測可能是BBR的細(xì)胞毒性隨濃度增大而逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)生對足細(xì)胞的損傷。故對于足細(xì)胞的后續(xù)B

16、BR給藥濃度確定為30μmol/L，60μmol/L和90μmol/L。
　　6. VEGF對腎小球系膜細(xì)胞生長增殖的影響
　　CCK-8法細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，高糖和VEGF均能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞明顯過度增殖；當(dāng)VEGF濃度達(dá)到2ng/ml時，系膜細(xì)胞的增殖達(dá)到最高值，此后隨VEGF濃度增高，系膜細(xì)胞的增殖出現(xiàn)抑制。
　　7. BBR對大鼠血清和系膜細(xì)胞上清液中的AGEs含量的影響
　　ELISA法檢測結(jié)果顯示，DN

17、模型大鼠血清和高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞上清液中AGEs含量明顯高于正常組；各劑量和濃度的BBR均具有顯著的抑制作用，其中，中劑量（濃度）和高劑量（濃度）組的BBR效果強(qiáng)于低劑量（濃度）組。
　　8. BBR對系膜細(xì)胞中AGEs-RAGE通路的影響
　　Western bolt法結(jié)果顯示，DN狀態(tài)下的系膜細(xì)胞AGEs、RAGE、p-PKC-β和TGF-β1的表達(dá)明顯高于正常組；不同濃度的BBR均具有顯著的抑制作用，其中，中濃度組的B

18、BR（60μmol/L）抑制效果最強(qiáng)。當(dāng)使用AGEs刺激系膜細(xì)胞后，RAGE、p-PKC-β和TGF-β1的表達(dá)顯著升高，但BBR此時無抑制作用；而阻斷劑Ab-RAGE能顯著降低p-PKC-β和TGF-β1的表達(dá)。激光共聚焦法結(jié)果顯示，RAGE在DN狀態(tài)下的系膜細(xì)胞上主要表達(dá)為膜性蛋白，此時細(xì)胞膜上RAGE表達(dá)明顯高于正常組，而BBR能夠有效的抑制膜性RAGE的過表達(dá)。
　　9. BBR對足細(xì)胞/系膜細(xì)胞之間VEGF-VEGFR2

19、通路的影響
　　蛋白芯片檢測足細(xì)胞上清液結(jié)果顯示，VEGF表達(dá)水平在DN狀態(tài)下顯著升高。Western bolt法檢測結(jié)果顯示，模型組足細(xì)胞分泌的VEGF蛋白相比正常組顯著升高，BBR給藥組可以有效降低VEGF的含量；高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞的p-VEGFR2相比正常組表達(dá)增多，而VEGF刺激后，系膜細(xì)胞的p-VEGFR2的表達(dá)升高更加明顯，不同濃度的BBR均有不同程度的改善作用。使用足細(xì)胞上清液刺激系膜細(xì)胞，p-VEGFR2的表達(dá)升高

20、顯著，中濃度的BBR和VEGF抑制劑均可以有效抑制p-VEGFR2的過表達(dá)。激光共聚焦法檢測結(jié)果顯示，足細(xì)胞中VEGF彌散性分布，為分泌性因子；系膜細(xì)胞中p-VEGFR2主要分布于細(xì)胞膜上，而BBR可以顯著性的降低VEGFR2的磷酸化。
　　結(jié)論：1. BBR可以有效的改善DN大鼠的腎功能，降低血糖，保護(hù)腎臟，改善DN大鼠的腎臟組織病理學(xué)。
　　2. DN狀態(tài)下AGEs-RAGE通路在大鼠腎臟中的下游因子包括PKC-β和TG