荔枝核總皂苷對Aβ1-42誘導BV-2細胞活化的抑制.pdf

1、目的：研究荔枝核總皂苷對Aβ1-42誘導BV-2細胞活化的抑制作用。方法：（1）CCK-8法、酶標儀檢測BV-2細胞增殖的OD值，并計算增殖相對百分率（reletive growth rate，RGR），以評價荔枝核總皂苷對BV-2細胞的安全濃度。（2）ELISA測上清液炎性因子白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環(huán)

2、氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)的含量，倒置顯微鏡觀察BV-2細胞形態(tài)學，以此評價Aβ1-42誘導BV-2細胞活化最適濃度及荔枝核總皂苷抑制BV-2細胞活化的最適濃度和時間。（3）瑞氏-姬姆薩染色、光學顯微鏡觀察荔枝核總皂苷抑制BV-2細胞活化的形態(tài)學變化；實時熒光定量PCR（Quantitative Rea l-time PCR）測定炎性因子IL-1β、iNOS、COX-2的基因表達；免疫印跡法（Weste

3、rn blot）檢測IL-1β、iNOS、COX-2的蛋白表達，以評價荔枝核總皂苷對Aβ1-42誘導BV-2細胞活化的抑制作用。結(jié)果：（1）荔枝核總皂苷安全濃度：與對照組比較，7.5mg·L-1-240mg·L-1荔枝核總皂苷作用BV-2細胞24h，細胞相對增殖百分率明顯降低(P＜0.05)；0.117mg·L-1-3.75mg·L-1荔枝核總皂苷對BV-2細胞增殖的相對百分率無影響。（2）Aβ1-42誘導BV-2細胞活化的最適濃度：與

4、對照組比較，1.25μmol·L-1-10μmol·L-1Aβ1-42能增加BV-2細胞釋放IL-1β、COX-2(P＜0.05,P＜0.01)；0.625μmol·L-1-10μmol·L-1Aβ1-42使BV-2細胞釋放iNOS增加(P＜0.05,P＜0.01)；倒置顯微鏡(×200)下，對照組BV-2細胞呈圓或橢圓形、細胞突起、抱團現(xiàn)象較少，核規(guī)則、完整；0.625μmol·L-1-10μmol·L-1Aβ1-42組細胞數(shù)量減少、

5、胞體膨大、形狀不規(guī)則，突起明顯等活化標志，其中以5、10μmol·L-1Aβ1-42最為明顯。（3）荔枝核總皂苷抑制BV-2細胞活化的有效濃度及最佳時間：倒置顯微鏡（×200）下，對照組細胞數(shù)量較多，胞體呈圓形或橢圓形，突起少；模型組細胞數(shù)量減少、胞體膨大、形狀不規(guī)則，突起明顯；0.015mg·L-1-0.469mg·L-1荔枝核總皂苷加入經(jīng)Aβ1-42預處理的BV-2細胞共同培養(yǎng)12h，可增加BV-2細胞數(shù)量，減少細胞突起、膨脹及抱團

6、現(xiàn)象；0.938mg·L-1-3.75mg·L-1荔枝核總皂苷加入經(jīng)Aβ1-42預處理的BV-2細胞共同培養(yǎng)12h及0.015mg·L-1-3.75mg·L-1荔枝核總皂苷+Aβ1-42+BV-2細胞共同培養(yǎng)24h均對活化的BV-2細胞形態(tài)學改變無影響。荔枝核總皂苷作用于Aβ1-42預處理BV-2細胞12h，0.059mg·L-1-0.469 mg·L-1荔枝核總皂苷可明顯減少IL-1β含量（P＜0.05，P＜0.01）；0.007mg

7、·L-1-0.469 mg·L-1荔枝核總皂苷可明顯減少COX-2含量（P＜0.05，P＜0.01）；0.117 mg·L-1-0.469 mg·L-1荔枝核總皂苷可明顯降低iNOS含量(P＜0.01)。荔枝核總皂苷、Aβ1-42和BV-2細胞共同培養(yǎng)24h，0.015mg·L-1-0.059 mg·L-1荔枝核總皂苷可明顯減少IL-1β含量（P＜0.05）；0.029mg·L-1、0.059 mg·L-1荔枝核總皂苷可降低iNOS含量

8、（P＜0.05），不同濃度荔枝核總皂苷對C OX-2含量影響不明顯。（4）荔枝核總皂苷對BV-2活化的抑制：①光學顯微鏡下（×200），對照組細胞呈圓形或橢圓形，突起少，無核碎裂現(xiàn)象，模型組細胞膨脹變形、突起多，核碎裂明顯；0.117mg·L-1-0.469mg·L-1荔枝核總皂苷組的細胞突起明顯減少，膨脹變形及核碎裂現(xiàn)象均不明顯。②與對照組比較，模型組IL-1β，COX-2，iNOS mRNA表達水平出現(xiàn)明顯升高(P＜0.01)；與模

9、型組比較，0.117mg·L-1-0.469mg·L-1均可減少IL-1β、COX-2、iNOS mRNA表達(P＜0.01)，但不同劑量組間比較差異不明顯。③與對照組比較，模型組COX-2、IL-1β、iNOS蛋白表達的條帶顏色加深、寬度增加，平均灰度值水平明顯增高；與模型組相比較，0.117mg·L-1-0.469mg·L-1荔枝核總皂苷組的COX-2、IL-1β、iNOS蛋白表達的條帶顏色變淡、寬度變窄，且灰度值水平明顯降低（P＜

10、0.05，P＜0.01)結(jié)論：（1）≤3.75mg·L-1荔枝核總皂苷對BV-2細胞無毒性，可在此濃度以下進行體外藥效學實驗。（2）5μmol·L-1和10μmol·L-1 Aβ1-42均可很好地誘導BV-2細胞活化。（3）荔枝核總皂苷抑制誘導BV-2活化安全有效的濃度為0.117mg·L-1-0.469mg·L-1、時間為12h。（4）荔枝核總皂苷可有效抑制BV-2細胞活化，減少炎性因子IL-1β、iNOS、COX-2的基因及蛋白表達