積雪草苷抑制TLR4-NF--κB信號通路減輕Aβ1-42誘導(dǎo)hBMECs凋亡.pdf

1、目的：人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cells，hBMECs)凋亡是阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）發(fā)病機(jī)制之一。hBMECs是血腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的主要成分之一，β淀粉樣肽1-42(amyloid-β1-42，Aβ1-42)通過誘導(dǎo)hBMECs凋亡引起血腦屏障通透性增加，沉積于神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞

2、死，功能受損，促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展。Aβ誘導(dǎo)hBMECs凋亡機(jī)制目前并不清楚，可能與TLR4/NF-κB信號通路激活有關(guān)。積雪草苷(Asiaticoside，AS)具有抗炎，抗氧化以及抗凋亡作用，但對Aβ誘導(dǎo)的hMECs凋亡有無抑制作用及作用機(jī)制是否與抑制TLR4/NF-κB信號通路激活有關(guān)并不清楚。因此，本研究通過建立Aβ誘導(dǎo)hBMECs細(xì)胞凋亡模型，探索積雪草苷對Aβ1-42誘導(dǎo)hBM ECs凋亡的作用，并闡明其作用機(jī)制，為積雪草苷用

3、于預(yù)防阿爾茨海默病提供理論依據(jù)。
　　方法：(1)積雪草苷干預(yù)濃度選擇：用不同濃度積雪草苷(3.125μmol/L，6.25μmol/L,12.5μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)分別處理hBMECs6h，12h，24h，48h，CCK-8法檢測hBMECs細(xì)胞活性。(2)Aβ1-42刺激hBMECs最適濃度和時間：用不同濃度Aβ1-42(12.5，25，50，100，200

4、μmol/L)分別處理hBMECs6h，12h，24h，48h，CCK-8法檢測hBMECs細(xì)胞活性。(3)CCK-8法檢測積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后細(xì)胞活性影響：將細(xì)胞分為陰性對照組，模型組，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L組，TAK-242組。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞hBMECs后，陰性對照組不做處理，模型組采用50μmol/LAβ1-42處理24h，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100

5、μmol/L，TAK-242組先分別采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L濃度的積雪草苷及1μmol/LTAK-242預(yù)處理hBMECs12h，再用50μmol/LAβ1-42處理細(xì)胞24h，CCK-8法檢測細(xì)胞活性;(4)Hoechst33258染色檢測積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡影響：將細(xì)胞分為陰性對照組，模型組，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L組，TAK-242組。

6、常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞hBMECs后，陰性對照組不做處理，模型組采用50μmol/LAβ1-42處理24h，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242組先分別采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L濃度的積雪草苷及1μmol/LTAK-242預(yù)處理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42處理細(xì)胞24h，采用Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡情況;(5)AnnexinⅤ-FI

7、TC檢測積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡率影響：將細(xì)胞分為陰性對照組，模型組，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L組，TAK-242組。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞hBMECs后，陰性對照組不做處理，模型組采用50μmol/LAβ1-42處理24h，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242組先分別采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L濃度的積雪草苷及1μmo

8、l/LTAK-242預(yù)處理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42處理細(xì)胞24h，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;(6)JC-1染色檢測積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后線粒體膜電位影響：將細(xì)胞分為陰性對照組，模型組，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L組，TAK-242組。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞hBMECs后，陰性對照組不做處理，模型組采用50μmol/LAβ1-42處理24h，積雪草苷25μmol/

9、L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242組先分別采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L濃度的積雪草苷及1μmol/L的TAK-242預(yù)處理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42處理細(xì)胞24h，JC-1染色后采用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞線粒體膜電位;(7)Western blot法檢測積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后MyD88依賴的TLR4信號通路主要蛋白表達(dá)影響：將細(xì)胞分為陰性對照組

10、，模型組，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L組，TAK-242組。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞hBMECs后，陰性對照組不做處理，模型組采用50μmol/LAβ1-42處理24h，積雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242組先分別采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L濃度的積雪草苷及1μmol/LTAK-242預(yù)處理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42

11、處理細(xì)胞24h，采用Western blot檢測TLR4，MyD88，TRAF6，p-NF-κB p65，total NF-κB p65蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：(1)積雪草苷干預(yù)濃度選擇：與陰性對照組比較，積雪草苷100μmol/L以下濃度處理不同時間后細(xì)胞活性無明顯變化，積雪草苷200μmol/L處理細(xì)胞24h，48h活力稍下降，但比較無顯著差異(p＞0.05)。(2)Aβ1-42刺激hBMECs最適濃度和時間：與陰性對照組比

12、較，Aβ1-4212.5，25μmol/L處理6h，12h，24h,48h,Aβ1-4250,100μmol/L處理hBMECs6h,12h,Aβ1-42200μmol/L處理6h細(xì)胞活性無明顯變化，比較無顯著差異(p＞0.05);Aβ1-4250，100μmol/L處理hBMECs24h，48h，Aβ1-42200μmol/L處理12h，24h，48h細(xì)胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。(3)積雪草苷對A

13、β1-42刺激hBMECs后細(xì)胞活性影響：與陰性對照組比較，模型組細(xì)胞活性明顯降低(p＜0.01);與模型組比較，積雪草苷25μmol/L組，50μmol/L組，100μmol/L組和TAK-242組可增加細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。(4)積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡影響：與陰性對照組比較，模型組出現(xiàn)亮藍(lán)色細(xì)胞核比例增加，即凋亡細(xì)胞增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與模型組比較，積雪草

14、苷各濃度組和TAK-242組凋亡細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(5)積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡率影響：與陰性對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與模型組比較，積雪草苷各濃度組和TAK-242組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(6)積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后線粒體膜電位影響：與陰性對照組比較，模型組hBMECs細(xì)胞膜電位明顯降低，差異有統(tǒng)計

15、學(xué)意義(p＜0.05);與模型組比較，積雪草苷各濃度組和TAK-242組細(xì)胞明顯增加由Aβ1-42(50μM)降低的線粒體膜電位，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。(7)積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后TLR4信號通路蛋白表達(dá)影響：與陰性對照組比較，模型組TLR4，MyD88，TRAF6，p-NF-κB p65等蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)：與模型組比較，積雪草苷各濃度組和TAK-242組細(xì)胞TLR4，My

16、D88，TRAF6，p-NF-κB p65等蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。(8)積雪草苷對Aβ1-42刺激hBMECs后細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65核轉(zhuǎn)移影響：與陰性對照組比較，模型組可明顯增加NF-κB p65核轉(zhuǎn)移陽性細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);與模型組比較，積雪草苷各濃度組和TAK-242組NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的陽性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(9)積雪草苷對Aβ1-42刺激h

17、BMECs后炎癥因子TNF-α及IL-6影響：與陰性對照組比較，模型組顯著誘導(dǎo)hBMECs細(xì)胞釋放炎性因子TNF-α及IL-6，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與模型組比較，積雪草苷各濃度組和TAK-242組細(xì)胞TNF-α及IL-6表達(dá)水平明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　結(jié)論：(1)積雪草苷可以降低Aβ1-42誘導(dǎo)的hBMECs細(xì)胞凋亡。(2)積雪草苷可以抑制TLR4/NF-κB信號通路中TLR4，MyD88，