多黏菌素與糖肽類抗生素聯(lián)合對泛耐藥鮑曼不動桿菌的體內(nèi)外抗菌活性研究.pdf

1、目的：
　　探討糖肽類抗生素萬古霉素或達(dá)托霉素聯(lián)合多黏菌素對泛耐藥鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性；
　　初步建立鮑曼不動桿菌大蠟螟幼蟲感染模型，并采用該模型評估糖肽類與多黏菌素聯(lián)合的體內(nèi)抗菌作用，為臨床以多黏菌素為基礎(chǔ)的抗菌藥物聯(lián)合治療鮑曼不動桿菌感染奠定理論基礎(chǔ)；
　　通過體外和大蠟螟幼蟲體內(nèi)實驗比較多黏菌素耐藥株與敏感株在生長速率、體內(nèi)毒力以及生長競爭能力方面的差別，探討鮑曼不動桿菌對多黏菌素產(chǎn)生耐藥是否存在生物學(xué)代價

2、。
　　材料與方法：
　　菌株來源
　　主要包括6株鮑曼不動桿菌，其中1株為鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19606，2株為多黏菌素敏感株，分離于2012~2013年度安徽地區(qū)住院患者的臨床標(biāo)本；其余3株均為上述3株多黏菌素敏感株在體外篩選獲得的耐藥株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853，均由安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心保存。
　　方法
　　1.以ATCC19606與臨床分離的2株

3、(GN2231與GN0653)對多黏菌素敏感的鮑曼不動桿菌為母株，采用體外連續(xù)培養(yǎng)法篩選多黏菌素耐藥突變株；根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會推薦的肉湯稀釋法測定6株鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物的最低抑菌濃度；聚合酶鏈反應(yīng)法檢測6株待測菌的碳青霉烯類和多黏菌素的耐藥基因；異質(zhì)性菌群譜分析法檢測3株對多黏菌素敏感的菌株是否包含異質(zhì)性耐藥亞群；采用棋盤法、時間-殺菌曲線實驗、防耐藥突變濃度測定及生物膜抑制實驗評估多黏菌素聯(lián)合糖肽類抗生素萬古霉

4、素或達(dá)托霉素的體外聯(lián)合抗菌活性。
　　2.通過腹足注射不同數(shù)量級濃度的活菌菌液至大蠟螟幼蟲體內(nèi)，檢測 ATCC19606與GN2231的細(xì)菌毒力以及不同濃度的菌液導(dǎo)致的幼蟲死亡率差異；注射熱力致死菌株檢測死亡細(xì)菌菌體對幼蟲生存率影響；將注射同樣菌液濃度的幼蟲置于不同溫度的孵育環(huán)境，檢測環(huán)境溫度對幼蟲死亡率的影響；模擬人體給藥劑量給予幼蟲體內(nèi)注射5種抗菌藥物(頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、慶大霉素和左氧氟沙星)，檢測抗菌藥物

5、對幼蟲感染的保護作用，并繪制出經(jīng)不同抗菌藥物治療后的生存曲線，了解抗菌藥物體外藥敏與幼蟲體內(nèi)療效的一致性；通過給藥后幼蟲體內(nèi)血淋巴細(xì)菌負(fù)荷測定，證實體外敏感的抗菌藥物在幼蟲體內(nèi)是否可以發(fā)揮抗菌作用，降低蟲體內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷。經(jīng)過以上檢測初步建立鮑曼不動桿菌大蠟螟幼蟲感染模型。
　　3.采用大蠟螟幼蟲感染模型測定上述6株菌的毒力及致死劑量；根據(jù)6株菌的致死劑量注射入幼蟲體內(nèi)，2小時內(nèi)給予模擬人體給藥劑量的多黏菌素單藥以及分別聯(lián)合萬古霉素或

6、達(dá)托霉素，每24小時觀察記錄幼蟲死亡數(shù)量至96小時，繪制生存曲線圖，分析不同給藥方式的大蠟螟幼蟲存活率；以致死劑量的泛耐藥鮑曼不動桿菌臨床株GN2231感染大蠟螟幼蟲，分別于感染前和感染后2小時給予幼蟲1mg/kg、10mg/kg和20mg/kg三個濃度梯度的萬古霉素進行治療，每24小時觀察記錄幼蟲死亡數(shù)量至96小時，繪制生存曲線圖，分析不同給藥劑量的萬古霉素對幼蟲的保護作用。
　　4.采用體外競爭實驗及生長速率測定法，涂板法計算

7、敏感菌和耐藥菌在0、4、8、12、24、和48h時間點的菌落數(shù)，并計算體外競爭指數(shù)繪制競爭性生長折線圖，比較多黏菌素敏感株與對應(yīng)的耐藥突變株在單獨生長及等濃度混合生長時生長能力的差別；采用大蠟螟幼蟲模型，每只幼蟲均注射等量的每對敏感菌和耐藥菌的混合菌液，在0、4、8、12和24h時間點，隨機挑選5只大蠟螟幼蟲研磨，涂板計數(shù)幼蟲血淋巴內(nèi)菌落數(shù)，計算各時間點的蟲體總細(xì)菌負(fù)荷，并計算體內(nèi)競爭指數(shù)繪制競爭性生長折線圖；采用同樣的方法，測定每對敏

8、感菌與耐藥菌單獨在幼蟲體內(nèi)的生長速率，繪制生長速率折線圖，分析每對敏感株及耐藥株體內(nèi)生長競爭和生長速率的差別。
　　結(jié)果：
　　1. ATCC19606除對糖肽類抗生素外均表現(xiàn)為敏感；GN2231和GN0653除對替加環(huán)素和多黏菌素敏感外，對其他的抗菌藥物均表現(xiàn)為耐藥；19606R、GN2231R和GN0653R對多黏菌素的MIC分別為8 mg/L、32 mg/L和16 mg/L。6株鮑曼不動桿菌均攜帶OXA-51基因，除1

9、9606和19606耐藥突變株之外，其余4株菌同時攜帶OXA-23和OXA-51基因，19606R pmrB基因突變導(dǎo)致氨基酸置換(Ala227Val)；3株多黏菌素敏感菌均檢測出異質(zhì)性耐藥亞群；體外聯(lián)合藥敏實驗、MPC實驗與生物膜抑制實驗中，多黏菌素與萬古霉素或達(dá)托霉素聯(lián)合均表現(xiàn)出較強的協(xié)同效應(yīng)；殺菌曲線實驗中，達(dá)托霉素與萬古霉素單藥對6株鮑曼不動桿菌均無殺菌活性，2種聯(lián)合對多黏菌素敏感株展現(xiàn)出較強的協(xié)同殺菌效應(yīng)，且萬古霉素-多黏菌素

10、聯(lián)合對19606與GN2231的耐藥突變株亦表現(xiàn)出協(xié)同殺菌效應(yīng)。
　　2.鮑曼不動桿菌對大蠟螟幼蟲的致死能力表現(xiàn)出菌液濃度依賴性，且不同菌株的致死劑量不同，反映出各菌株之間不同的毒力；熱力致死菌株不能夠?qū)е掠紫x死亡，對生存曲線沒有影響；幼蟲感染后死亡率與孵育溫度有一定的相關(guān)性，同樣濃度的菌液注射幼蟲后，在37 ℃孵育溫度的環(huán)境中，比25 ℃時死亡率更高；幼蟲感染后，抗菌藥物單藥的治療效果與體外藥敏結(jié)果具有一致性，且與蟲體血淋巴細(xì)菌

11、負(fù)荷量呈一定的相關(guān)性，敏感的抗菌藥物可以降低幼蟲體內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷。
　　3.多黏菌素單藥對多黏菌素敏感株感染的幼蟲有較好的保護作用，尤其是ATCC19606；而對多黏菌素耐藥株感染的幼蟲，經(jīng)多黏菌素單藥治療后生存率并不高；萬古霉素-多黏菌素聯(lián)用對幼蟲的治療作用大于任何一種單藥的作用；達(dá)托霉素單藥對感染的幼蟲幾乎無作用，但達(dá)托霉素與多黏菌素聯(lián)合使用可提高多黏菌素敏感株感染的幼蟲的生存率，且其生存率高于單一用藥；此外，萬古霉素單藥治療鮑曼

12、不動桿菌感染的幼蟲時，對幼蟲有保護作用，可提高幼蟲的生存率，且這種保護作用呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)；而達(dá)托霉素則未表現(xiàn)出同樣的保護作用。
　　4.3株多黏菌素耐藥突變株對除多黏菌素外其他測試抗菌藥物的敏感性較敏感親本株有明顯升高；所有菌株均能夠形成生物膜，但3株多黏菌素耐藥株的生物膜形成能力遠(yuǎn)小于其敏感親本株；大蠟螟幼蟲實驗中，19606耐藥突變株的毒力小于19606；體內(nèi)外生長與競爭實驗中，19606的生長競爭能力大于19606耐藥突

13、變株，以上結(jié)果表明多黏菌素敏感菌19606發(fā)生耐藥突變后，存在生物學(xué)代價，但 GN2231與 GN0653對多黏菌素耐藥后，未表現(xiàn)出相應(yīng)的生物學(xué)代價。
　　結(jié)論：
　　1.多黏菌素與萬古霉素或達(dá)托霉素聯(lián)合對泛耐藥鮑曼不動桿菌有體外協(xié)同抗菌活性，并能夠抑制細(xì)菌生物膜形成與降低多黏菌素的防耐藥突變濃度。體外對多黏菌素保持敏感的鮑曼不動桿菌中存在異質(zhì)性耐藥亞群是導(dǎo)致多黏菌素單藥殺菌時再生長的原因之一。
　　2.通過蟲體內(nèi)注射

14、最低致死劑量的鮑曼不動桿菌成功建立了大蠟螟幼蟲感染模型，該模型為研究鮑曼不動桿菌的體內(nèi)毒力和抗菌藥物活性提供了一種較為可靠的動物模型。
　　3.在感染的大蠟螟幼蟲體內(nèi)，多黏菌素聯(lián)合萬古霉素或達(dá)托霉素較多黏菌素單藥有更好的療效，與體外聯(lián)合實驗一致。在體外對鮑曼不動桿菌無任何抗菌活性的萬古霉素單藥對感染的大蠟螟幼蟲具有較好的療效，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　4.多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌可能存在生物學(xué)代價，主要表現(xiàn)為耐藥突變株對大