促進(jìn)軸突生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子的篩選.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，受損的神經(jīng)軸突不能有效再生，致使被破壞的神經(jīng)環(huán)路無(wú)法有效重建，是阻礙神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的最主要原因。目前對(duì)于損傷神經(jīng)元的再生修復(fù)治療策略主要集中于改善損傷區(qū)微環(huán)境，減少神經(jīng)軸突再生的不利因素；神經(jīng)干細(xì)胞的移植，新生的神經(jīng)元替代失去的神經(jīng)元，重建神經(jīng)環(huán)路；以及提高神經(jīng)元內(nèi)源性再生能力等方法。其中，提高神經(jīng)元內(nèi)源性的再生能力，是有效促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的基本方法之一。轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF）是

2、一種DNA結(jié)合蛋白，能夠與基因上特異性的位點(diǎn)結(jié)合從而直接或間接的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，在發(fā)揮基因生物功能中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)分子和細(xì)胞生物學(xué)方法篩選多種與軸突生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并試圖將單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子或者多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合轉(zhuǎn)染到類(lèi)神經(jīng)元細(xì)胞PC12和神經(jīng)元當(dāng)中，觀察細(xì)胞突起生長(zhǎng)情況，找出對(duì)促進(jìn)細(xì)胞突起生長(zhǎng)有效的單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子的組合。
　　實(shí)驗(yàn)首先改造克隆及表達(dá)載體，獲得pCAGSJ載體；其次，通過(guò)文獻(xiàn)檢索，確定38種轉(zhuǎn)錄因子

3、為候選基因，利用RT-PCR及PCR的技術(shù)，獲得轉(zhuǎn)錄因子的編碼區(qū)序列（Coding DNA Sequence，CDS），并將其連接到經(jīng)過(guò)改造的真核表達(dá)載體上，經(jīng)過(guò)菌液PCR、酶切驗(yàn)證和測(cè)序后確定其序列連接的正確性；最后再通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將38種轉(zhuǎn)錄因子分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中，檢測(cè)細(xì)胞突起長(zhǎng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上述轉(zhuǎn)錄因子對(duì)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)均起到了一定的促進(jìn)作用，但是每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)突起生長(zhǎng)的能力各有不同，其中CREB、KLF4、p5

4、0、STAT3、Hb9、Batf、Sox10、SnoN、Lmx1a和Lhx3等10種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯，于是我們挑選上述10種轉(zhuǎn)錄因子作為我們后續(xù)篩選促軸突生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子組合的候選基因。然而從上述10種轉(zhuǎn)錄因子中是否能篩選出某種組合，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，我們需要解決以下兩個(gè)問(wèn)題：1，篩選策略；2，是否存在組合一定比單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子效果好。于是，我們挑選了CREB、p50、STAT3和KLF4四種轉(zhuǎn)錄因子，采用N-1的策略，即4

5、個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，每次只轉(zhuǎn)3個(gè)，觀察哪個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)突起生長(zhǎng)最為有效。我們采用以下轉(zhuǎn)錄因子組合：CREB+KLF4+p50、CREB+KLF4+STAT3、CREB+p50+STAT3、KLF4+p50+STAT3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺少CREB和STAT3轉(zhuǎn)錄因子的組合中，細(xì)胞突起最短，說(shuō)明CREB和STAT3對(duì)突起生長(zhǎng)最為重要。隨后驗(yàn)證CREB+STAT3組合效果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞突起最長(zhǎng)。該研究結(jié)果初步驗(yàn)證我們的假設(shè)：即N-1策略可以用于轉(zhuǎn)錄因子組