PCSK9-IDOL在姜黃素?zé)熕狨ゴ龠M(jìn)肝細(xì)胞攝取LDL的作用及機制.pdf

1、血漿LDL-C水平升高是動脈粥樣硬化性心血管疾病最重要的危險因素，國內(nèi)外血脂異常防治協(xié)會均指出以降低血漿LDL-C為首要目標(biāo)，且目標(biāo)值越低越好。他汀類作為降低LDL-C的首選藥物，在臨床中具有顯著降低LDL-C，減少ASCVD患病風(fēng)險的作用，然而不良反應(yīng)也顯現(xiàn)出來，在高危人群和易感人群易誘發(fā)肌痛、橫紋肌溶解癥及糖尿病等，已有文獻(xiàn)在Nature、BMJ雜志報道。他汀類的主要機理是通過競爭性抑制膽固醇合成的限速酶(HMGCR)降低LDL-C

2、，也有文獻(xiàn)報道他汀類還增高了LDLR蛋白表達(dá)。血漿中絕大多數(shù)的LDL-C經(jīng)LDLR內(nèi)吞循環(huán)代謝。LDLR功能障礙及內(nèi)吞循環(huán)量的減少均導(dǎo)致了血漿LDL-C的清除減弱，而LDLR功能缺失極易引起家族性高膽固醇血癥，使ASCVD患病風(fēng)險增高。為此研究LDLR在LDL-C的清除作用仍然必要。
　　LDLR主要受轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)錄水平主要受膽固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(SREBP2)的調(diào)節(jié)，靶基因除了LDLR外，還有HMGCR、P

3、CSK9及鯊烯單加氧酶等。抑制HMGCR的藥物他汀類已廣泛應(yīng)用于臨床。LDLR還受PCSK9及IDOL轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。PCSK9和LDLR雖然同受SREBP2轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，但PCSK9前體還具有協(xié)助LDLR成熟的作用，而成熟的PCSK9則調(diào)節(jié)LDLR內(nèi)吞經(jīng)溶酶體降解，為此，科學(xué)界研究學(xué)者曾對PCSK9結(jié)構(gòu)和功能的研究達(dá)到白炙化。現(xiàn)針對抑制PCSK9功能的藥物是PCSK9的單克隆抗體，已被美國FDA批準(zhǔn)用于不耐受他汀類且家族性高膽固醇

4、血癥患者的治療。IDOL則是2009年才首次被研究確定具有誘導(dǎo)LDLR泛素化經(jīng)溶酶體降解的作用，為此IDOL的中文名稱為誘導(dǎo)LDLR降解蛋白。關(guān)于IDOL具有降解LDLR降解作用的文獻(xiàn)報道后，脂質(zhì)研究學(xué)者開始關(guān)于IDOL在人群多態(tài)性影響LDL-C代謝的研究，已經(jīng)明確IDOL功能缺失與As成反比，反之IDOL功能性獲得則促進(jìn)了LDL-C升高，加速了As進(jìn)程。為此，科學(xué)界提出抑制IDOL同樣可作為臨床降血脂藥物開發(fā)靶點的假說。
　　姜

5、黃素?zé)熕狨?CurTn)是將姜黃素兩個羥基引入煙酸羧基形成具有多個功能基團(tuán)的酯類衍生物，其姜黃素與煙酸均具有降低血漿LDL-C的作用，為此，我們前期研究結(jié)果顯示CurTn可顯著降低As模型小鼠LDL-C的作用，但機制不明。因LDL-C主要經(jīng)LDLR內(nèi)吞循環(huán)代謝，我們進(jìn)一步檢測了LDLR的表達(dá)水平，結(jié)果顯示LDLR的mRNA水平無顯著變化，而LDLR蛋白表達(dá)卻顯著增高。我們推測出CurTn可能通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)LDLR蛋白表達(dá)。為此提出了

6、CurTn調(diào)節(jié)PCSK9/IDOL促進(jìn)肝細(xì)胞攝取LDL的研究設(shè)想。為回答這一科學(xué)問題，在第一部分的研究中進(jìn)一步篩選了與LDL-C代謝有關(guān)基因的表達(dá)，并檢測了細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的變化，研究CurTn作用于LDLR蛋白表達(dá)的相關(guān)性。那么這一LDLR表達(dá)增高是否與增高了細(xì)胞膜LDLR內(nèi)吞循環(huán)量有關(guān)，在第二部分通過DiI-LDL攝取實驗及免疫熒光檢測細(xì)胞膜LDLR水平，研究CurTn對膽固醇攝取、LDLR內(nèi)吞循環(huán)量、PCSK9及IDOL蛋白表達(dá)的

7、影響。為了回答這一影響的特異性，在第三部分通過過表達(dá)及干擾PCSK9和IDOL的慢病毒載體感染HepG2細(xì)胞，研究CurTn引起的降低血漿LDL-C與PCSK9\IDOL特異性表達(dá)變化的影響，探討CurTn促進(jìn)肝細(xì)胞攝取LDL-C的作用靶點，為臨床調(diào)脂藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　第一部分、CurTn對HepG2細(xì)胞LDL-C攝取的影響
　　目的：明確CurTn降低血漿LDL-C的機制涉及到攝取LDL-C的增多，LDLR蛋白表

8、達(dá)增高。
　　方法：HepG2細(xì)胞在5％ CO2、37℃條件下用含有10%FBS和1%Penicillin-streptomycin的 DMEM培養(yǎng)液貼壁24h后，實驗分組：1: Basal;2:Control(25mg/L LDL);3:CurTn5μM(25mg/L LDL+CurTn5μM);4:CurTn10μM(25mg/L LDL+CurTn10μM);5:CurTn15μM(25mg/L LDL+CurTn15μM)

9、;6:EZE30μM(25mg/L LDL+Ezetimibe30μM)。CurTn與LDL共孵育體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，油紅O、熒光酶法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，RT-Q-PCR及Western Blotting檢測膽固醇代謝有關(guān)的基因INSIG1、SREBP2、LDLR、HMGCR、PCSK9的mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：與Control組比較，CurTn處理后油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)小紅色脂滴增多，熒光酶法結(jié)果顯示膽固醇含量顯

10、著增多。那么，這種增多是膽固醇攝取增多還是合成增多，進(jìn)一步通過RT-Q-PCR及Western Blotting結(jié)果顯示5、10μM CurTn對HMGCR的mRNA及蛋白表達(dá)無影響，僅在15μM CurTn組有升高的趨勢，表明CurTn對膽固醇合成無顯著影響；對SREBP2的mRNA及蛋白表達(dá)、LDLR mRNA表達(dá)無顯著差異，表明不是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)LDLR表達(dá)；CurTn促進(jìn)LDLR蛋白表達(dá)增多及PCSK9蛋白表達(dá)的減少，提示Cur

11、Tn可能轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)LDLR蛋白表達(dá)。
　　小結(jié)：CurTn使肝細(xì)胞膽固醇含量增多、LDLR蛋白表達(dá)增高，可能與PCSK9蛋白表達(dá)減少有關(guān)。
　　第二部分、CurTn促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C與PCSK9/IDOL調(diào)節(jié)細(xì)胞表面LDLR分布的相關(guān)性研究
　　目的：明確CurTn降低血漿LDL-C的機制是細(xì)胞攝取LDL-C增多，LDLR蛋白表達(dá)增高與降低PCSK9及IDOL蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　方法：按第一部分

12、實驗分組，CurTn與DiI-LDL共孵育體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，檢測CurTn對肝細(xì)胞攝取膽固醇能力的影響；免疫熒光流式細(xì)胞儀檢測CurTn對細(xì)胞膜LDLR分布豐度的影響；Western Blotting檢測轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)LDLR有關(guān)的基因IDOL、K48、K63及USP2的蛋白表達(dá)，免疫共沉淀檢測LDLR及IDOL泛素化水平，探究CurTn轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)LDLR表達(dá)可能的機制。
　　結(jié)果：與Control組比較，CurTn處理組橙紅色

13、熒光顯著增強，表明膽固醇攝取增多；免疫熒光流式結(jié)果顯示CurTn處理組細(xì)胞膜LDLR水平增多，表明CurTn通過細(xì)胞膜LDLR分布豐度的增多促進(jìn)LDL的攝??；Western Blotting結(jié)果顯示CurTn5、10、15μM處理后IDOL蛋白表達(dá)顯著降低；免疫共沉淀結(jié)果顯示CurTn5、10、15μM處理后LDLR泛素化程度顯著降低，表明CurTn通過降低IDOL引起了LDLR泛素化程度的降低；而CurTn處理組IDOL泛素化程度升高

14、，表明CurTn促進(jìn)了IDOL泛素化，可能加速了泛素化的IDOL經(jīng)蛋白酶體途徑降解使IDOL蛋白含量減少。隨后進(jìn)一步通過Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)CurTn處理組顯著降低USP2的表達(dá)，而在CurTn10、15μM高濃度組引起K48和K63表達(dá)顯著降低，結(jié)果表明CurTn引起LDLR去泛素化程度降低，USP2作用隨之減少，提示LDLR在溶酶體降解顯著減少。
　　小結(jié)：CurTn使肝細(xì)胞膽固醇攝取增多、細(xì)胞膜LDLR水

15、平增高，可能與IDOL、PCSK9蛋白表達(dá)減少有關(guān)。
　　第三部分、CurTn通過抑制PCSK9/IDOL的蛋白表達(dá)使HepG2的LDLR蛋白水平升高
　　目的：闡明CurTn特異性降低PCSK9及IDOL蛋白表達(dá)引起LDLR蛋白表達(dá)增高，促進(jìn)肝細(xì)胞攝取LDL的作用機制。
　　方法：構(gòu)建過表達(dá)IDOL及PCSK9慢病毒及各三種干擾IDOL及PCSK9的慢病毒，感染 HepG2細(xì)胞，形成穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，熒光顯微鏡檢測感染效率

16、，RT-Q-PCR及Western Blotting檢測IDOL及PCSK9表達(dá)水平，鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)效果；CurTn15μM作用前后對IDOL、PCSK9及慢病毒干擾/過表達(dá)IDOL感染HepG2細(xì)胞后LDLR蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：篩選出RNAi-IDOL及RNAi-PCSK9有效抑制表達(dá)序列的慢病毒載體用于后續(xù)實驗。RT-Q-PCR及Western Blotting結(jié)果顯示RNAi-IDOL及RNAi-PCSK9顯著抑制相應(yīng)的ID

17、OL及PCSK9的mRNA及蛋白表達(dá)，而LV-IDOL及LV-PCSK9則相應(yīng)顯著增高IDOL及PCSK9的mRNA及蛋白表達(dá)。感染HepG2細(xì)胞，選擇的條件為5μg/mL Polybrene及10%FBS DMEM，過表達(dá)慢病毒感染MOI為10，干擾MOI則為30，判斷的條件是細(xì)胞形態(tài)良好，感染率達(dá)到80%以上。嘌呤霉素2μg/mL篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)慢病毒細(xì)胞。CurTn15μM作用24h后，維持干擾RNAi-IDOL及RNAi-PCSK9引起