microRNA-195在肝細胞L02葡萄糖攝取中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　葡萄糖攝取是機體內新陳代謝中極其重要的一個生物進程且調控著人類機體內的多個信號通路及蛋白表達，葡萄糖攝取障礙會導致胰島素抵抗以及其他代謝的異常，進而誘發(fā)糖尿病以及癌癥等威脅人類健康的各種疾病。棕櫚酸（PA）做為飽和脂肪酸的一種已經(jīng)被證明了可以誘導肝細胞形成葡萄糖攝取障礙，建立胰島素抵抗模型。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類非編碼的小分子單鏈RNA，通過與其目標mRNA分子的3'端(3'UTR)互

2、補匹配導致該mRNA分子的翻譯受到抑制，而后在分子水平上調控各種信號通路。有大量研究結果顯示miRNAs可以調控葡萄糖動態(tài)平衡。miR-195也已經(jīng)被證明，可以調控多種信號通路及蛋白的表達且與糖尿病的發(fā)生及發(fā)展有著密切關聯(lián)，但其對葡萄糖攝取進程的影響及具體分子機制尚不明確。
　　研究目的：
　　1．明確miR-195在棕櫚酸誘導的肝細胞L02葡萄糖攝取障礙中是否表達異常；
　　2．驗證miR-195是否調控肝細胞L02

3、的葡萄糖攝取障礙進程；
　　3．miR-195靶基因的篩選及驗證；
　　4．探究miR-195在肝細胞L02葡萄糖攝取障礙中的具體機制。
　　第一部分 PA處理肝細胞L02后microRNA-195表達變化情況
　　以不同濃度棕櫚酸PA（0.6 mmol/L，1 mmol/L）分別誘導肝細胞L028h，于倒置顯微鏡下觀察處理后的肝細胞L02的形態(tài)，然后運用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測各個組中肝細胞L02的葡萄糖

4、攝取能力，RT-PCR技術檢測miR-195的表達變化情況。
　　研究方法：
　　1．倒置顯微鏡下觀察棕櫚酸處理肝細胞L02后的形態(tài)變化；
　　2．葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測不同濃度棕櫚酸處理肝細胞 L02后葡萄糖攝取能力；
　　3．實時定量PCR檢測葡萄糖攝取障礙后miR-195表達變化。
　　實驗結果
　　1．顯微鏡下初步觀察到棕櫚酸（PA）處理的肝細胞L02的細胞形態(tài)明顯模糊化，邊緣不清晰無

5、明顯棱角且呈橢圓狀，細胞與細胞間隔松散無清晰界限，細胞核增大；
　　2．葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測結果證實（0.6 mmol/L和1 mmol/L）濃度的PA處理肝細胞 L02后細胞培養(yǎng)液上清中的葡萄糖濃度比對照組高，說明肝細胞L02在一定濃度棕櫚酸的誘導下葡萄糖攝取能力降低，且隨著PA濃度的提高，其葡萄糖攝取能力有越來越低的趨勢；
　　3．實時定量PCR檢測結果顯示肝細胞L02葡萄糖攝取障礙后miR-195表達升高。<

6、br>　　結論：
　　0.6 mmol/L，1 mmol/L的PA誘導肝細胞L02葡萄糖攝取障礙，且肝細胞L02葡萄糖攝取障礙后miR-195高表達。
　　第二部分 microRNA-195對肝細胞L02葡萄糖攝取的影響
　　葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測高表達及低表達miR-195后其葡萄糖攝取能力的變化以及棕櫚酸處理高表達及低表達miR-195后的肝細胞L02的葡萄糖攝取能力的變化。Western-blot法驗證G

7、LUT1和GLUT4在高表達及低表達miR-195后的表達變化。
　　研究方法：
　　1．激光共聚焦檢測肝細胞L02轉染miR-195 mimic以及miR-195 inhibitor后的熒光強度，計算轉染效率；
　　2．實時定量PCR檢測肝細胞L02轉染miR-195 mimic以及miR-195 inhibitor后的miR-195的表達；
　　3．葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測miR-195高表達及低表達后

8、肝細胞L02葡萄糖攝取能力的變化；葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測棕櫚酸處理miR-195高表達及低表達后的肝細胞L02的葡萄糖攝取能力的變化；
　　4．Western-blot法檢測miR-195高表達或低表達后GLUT1和GLUT4的表達。
　　實驗結果：
　　1．激光共聚焦檢測肝細胞L02轉染miR-195 mimic以及miR-195 inhibitor后的轉染效率達到40％；
　　2．實時定量PCR的結果

9、證實了肝細胞L02轉染miR-195 mimic后miR-195的表達升高，轉染miR-195 inhibitor后miR-195的表達降低；
　　3．葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法結果證實了過表達miR-195后肝細胞L02葡萄糖的攝取能力較Control降低，低表達miR-195后肝細胞L02葡萄糖攝取能力較Control組有所提高。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法的結果證實了PA誘導與miR-195高表達同時干預有增強葡萄糖攝取障礙的

10、趨勢；
　　4．Western-blot的結果證明了高表達miR-195下調葡萄糖轉運體GLUT1的表達。
　　結論：
　　過表達 miR-195后肝細胞L02的葡萄糖攝取能力較對照組降低，而低表達miR-195后肝細胞L02葡萄糖攝取能力較對照組有所提高；櫚酸處理與miR-195高表達同時作用于肝細胞L02可加強其葡萄糖攝取障礙；過表達miR-195可下調葡萄糖轉運體GLUT1的表達。
　　第三部分 micro

11、RNA-195靶基因Sirt-1的預測及驗證
　　基于多種數(shù)據(jù)庫分析預測 miR-195的靶基因以及 Western-blot法驗證其是否為miR-195的靶基因，并探究其靶基因與葡萄糖代謝相關蛋白之間的作用機制。
　　研究方法：
　　1．基于多種數(shù)據(jù)庫分析預測miR-195的靶基因；
　　2．Western-blot檢測miR-195高表達及低表達后候選靶基因Sirt-1的表達變化；
　　3．Wester

12、n-blot檢測Sirt-1表達被干涉后GLUT1和GLUT4的表達變化。
　　實驗結果：
　　1．多種數(shù)據(jù)庫分析預測miR-195的靶基因可能性較大的為Sirt-1；
　　2．Western-blot檢測miR-195高表達后Sirt-1表達降低，低表達后Sirt-1表達升高；
　　3．Western-blot檢測Sirt-1表達被干涉后GLUT1和GLUT4表達均降低。
　　結論：
　　miR-1