何首烏飲對(duì)衰老大鼠生精細(xì)胞胰島素通路IRSI、IGF-1、IGFBP3基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討何首烏飲對(duì)衰老大鼠生精細(xì)胞胰島素信號(hào)通路IRS1、IGF-1、IGFBP3基因表達(dá)的影響。
　　方法：
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1．實(shí)驗(yàn)分組及處理選用30只清潔級(jí)12月齡Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為：青年對(duì)照組(YCG)，自然衰老組(NAG)，何首烏飲組(SWYG)，每組各10只。青年對(duì)照組適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后取材；自然衰老組在飼養(yǎng)到16月齡后灌胃等量蒸餾水60d；何首烏飲組在飼養(yǎng)到16月齡后，灌胃何首烏飲(4.8

2、g/100g)60d；自然衰老組和何首烏飲組均于18月齡時(shí)取材，備用。
　　2．觀察睪丸組織IRS1、IGF-1、IGFBP3基因表達(dá)采用免疫熒光染色觀察IRS1、IGF-1、IGFBP3在睪丸組織的表達(dá)位置，Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)睪丸組織IRS1、IGF-1、IGFBP3蛋白和mRNA表達(dá)的變化。
　　二、體外實(shí)驗(yàn)
　　1．細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定組合酶法分離細(xì)胞，Percoll梯度密度

3、離心和差異貼壁法純化細(xì)胞，利用蘇丹Ⅳ染液鑒定支持細(xì)胞并計(jì)算支持細(xì)胞的純度；分別利用堿性磷酸酶染色、孚耳根染色、HE染色鑒定生精細(xì)胞。
　　2．衰老模型的建立將培養(yǎng)至7d的生精細(xì)胞，加入終濃度為50μmol/L的H2O2和100μmol/L FeSO4，連續(xù)干預(yù)8h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h；采用β-半乳糖甘酶特異性染色試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組中生精細(xì)胞β-半乳糖甘酶的表達(dá)情況，以判斷衰老模型是否建立成功。
　　3．實(shí)驗(yàn)分組及處理根據(jù)實(shí)

4、驗(yàn)?zāi)康姆譃椋赫?duì)照組(NCG)，將培養(yǎng)至7d的生精細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)80h；衰老模型組(AMG)，將培養(yǎng)至7 d的生精細(xì)胞，加入終濃度為50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4，連續(xù)干預(yù)8h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h；何首烏飲組(SWYG)，將培養(yǎng)至7d的生精細(xì)胞，加入終濃度分別為50μmol/L的H2O2和100μmol/L FeSO4，連續(xù)干預(yù)8h，換液，加入終濃度為10％的何首烏飲含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)72h。
　　

5、4．采用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因IRS1、IGF-1、IGFBP3在生精細(xì)胞的蛋白表達(dá)變化以及其mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.免疫熒光檢測(cè)結(jié)果IRS1陽(yáng)性產(chǎn)物發(fā)紅色熒光，定位在細(xì)胞膜，細(xì)胞核采用DAPI染色呈藍(lán)色，IRS1陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)在精母細(xì)胞、支持細(xì)胞和肌樣細(xì)胞。與青年對(duì)照組相比，自然衰老組IRS1陽(yáng)性率明顯降低(P＜0.01)，何首烏飲干預(yù)后，與

6、自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IRS1陽(yáng)性率明顯升高(P＜0.01)。IGF-1陽(yáng)性產(chǎn)物發(fā)綠色熒光，定位在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核采用DAPI染色呈藍(lán)色，IGF-1陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)在精子細(xì)胞。與青年對(duì)照組相比，自然衰老組IGF-1陽(yáng)性率明顯降低(P＜0.01)，何首烏飲干預(yù)后，與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IGF-1陽(yáng)性率明顯升高(P＜0.01)。IGFBP3陽(yáng)性產(chǎn)物發(fā)綠色熒光，定位在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核采用 DAPI染色呈藍(lán)色，IGFBP3陽(yáng)性產(chǎn)物

7、在精原細(xì)胞和少量間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組IGFBP3陽(yáng)性率明顯升高(P＜0.01)，何首烏飲干預(yù)后，與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組陽(yáng)性率明顯降低(P＜0.01)。
　　2.Western blot檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組IGFBP3表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，IRS1、IGF-1表達(dá)明顯減少(P＜0.01)；與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IGFBP3表達(dá)量明顯減少(P＜

8、0.01)，IRS1、IGF-1表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)。
　　3.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組IGFBP3 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，IRS1、IGF-1的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)；與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IGFBP3表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)，IRS1、IGF-1的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。
　　以上結(jié)果表明，何首烏飲可以通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵基因

9、IRS1、IGF-1、IGFBP3的表達(dá)延緩大鼠睪丸組織的衰老，為了進(jìn)一步分析何首烏飲對(duì)衰老大鼠生精功能的調(diào)控機(jī)制，我們采用支持細(xì)胞和生精細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，檢測(cè)基因IRS1、IGF-1、IGFBP3在生精細(xì)胞的表達(dá)變化。
　　二、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.蘇丹Ⅳ染色結(jié)果顯示支持細(xì)胞純度可達(dá)90%以上。
　　2.β-半乳糖甘酶特異性染色結(jié)果β-半乳糖甘酶特異性染色結(jié)果顯示，β-半乳糖苷酶陽(yáng)性產(chǎn)物定位在生精細(xì)胞質(zhì)中。衰老模型

10、組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；何首烏飲含藥血清干預(yù)后，與衰老模型組相比，何首烏飲組陽(yáng)性率明顯降低（P＜0.01）。
　　3.Western blot檢測(cè)結(jié)果Western blot檢測(cè)生精細(xì)胞IRS1、IGF-1、IGFBP3蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，衰老模型組IRS1、IGF-1表達(dá)下調(diào)，IGFBP3表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，何首烏飲含藥血清干預(yù)后，與衰老模型組相比，何首烏飲組IRS1、IG

11、F-1表達(dá)上調(diào)，IGFBP3表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)。
　　4.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 qRT-PCR檢測(cè)生精細(xì)胞IRS1、IGF-1、IGFBP3在 mRNA水平的改變，與正常對(duì)照組相比，衰老模型組IRS1、IGF-1的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)，IGFBP3的表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)；何首烏飲含藥血清干預(yù)以后，與衰老模型組相比較，IRS1、IGF-1的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，IGFBP3的表達(dá)有所下調(diào)(P＜0.01)。

12、
　　結(jié)論：
　　1.何首烏飲可以通過(guò)提高衰老大鼠睪丸組織胰島素通路關(guān)鍵基因IRS1、IGF-1的表達(dá)，抑制IGFBP3的表達(dá)，延緩大鼠睪丸組織的衰老。
　　2.何首烏飲能夠降低衰老標(biāo)志物β-半乳糖苷酶在生精細(xì)胞的表達(dá)。
　　3.何首烏飲可以通過(guò)促進(jìn)生精細(xì)胞胰島素通路關(guān)鍵基因IRS1、IGF-1的表達(dá)，抑制IGFBP3的表達(dá)，延緩大鼠生精細(xì)胞的衰老。
　　綜上所述，何首烏飲通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵基因IR