何首烏飲對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響.pdf

1、運(yùn)動(dòng)性疲勞是指高強(qiáng)度超負(fù)荷的連續(xù)運(yùn)動(dòng),機(jī)體機(jī)能和運(yùn)動(dòng)負(fù)荷不能彼此適應(yīng),所導(dǎo)致的疲勞連續(xù)性積累,繼而所引發(fā)的一系列的機(jī)體功能紊亂或是病理狀態(tài)的產(chǎn)生。疲勞還將伴隨有一定的健康損害,即由于運(yùn)動(dòng)引起的機(jī)體生理和生化的改變,致使機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的暫時(shí)性下降。傳統(tǒng)中藥在延緩和消除疲勞方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),其中補(bǔ)腎方劑何首烏飲由《宣明論方》何首烏丸加味而成,在何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝的基礎(chǔ)上增加淫羊藿、丹參、茯苓,具有補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽,消除疲勞之功效

2、。本研究對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠進(jìn)行中藥干預(yù),觀察其對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠的血生化指標(biāo)和睪酮合成限速酶P450scc和StAR以及睪丸胞內(nèi)膽固醇合成限速酶HMG-CoA和SR-BI的表達(dá)影響。為進(jìn)一步研究中藥抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用及機(jī)理奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的:
　　采用生物化學(xué)、免疫組織化學(xué)、RT-PCR和WesternBlotting方法,通過(guò)檢測(cè)各組大鼠的血生化指標(biāo)以及睪丸組織P450scc、StAR和HMG-CoA、SR-BI的

3、表達(dá)。探討何首烏飲緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組:選用8周齡清潔級(jí)SD(Sprague–Dawley,SD)雄性大鼠75只,(動(dòng)物由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證編號(hào)1005050),每只體重為180～200g。自由進(jìn)食,飲水,室溫20℃-25℃,相對(duì)濕度45％-55%,每天光照12h,隨機(jī)分為6組:安靜對(duì)照組(A組)、安靜何首烏飲組(B組)、模型組(C組)、自然恢復(fù)組(D組)、何首烏

4、飲治療組(E組)和何首烏飲預(yù)防組(F組),每組15只。
　　2.建立大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型:游泳池內(nèi)壁光滑呈圓形,直徑約50cm,水深70cm,水溫30℃±2℃。第一周進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,每天一次,共七次。第1天下水游泳30min,此后逐日按照40%幅度增加至第7天游泳2h;從第二周開始適應(yīng)性負(fù)重游泳訓(xùn)練,第一次負(fù)重自身體重的0.5%,此后逐日遞增,負(fù)1%、2%、3%、4%每次游泳2h,每天一次。當(dāng)?shù)诹熵?fù)重增加到5%時(shí),游泳時(shí)間明顯

5、縮短,所以選擇自身體重的4%作為最終的負(fù)重量;此后六周每天一次進(jìn)行游泳力竭實(shí)驗(yàn)(游泳力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠游泳出現(xiàn)明顯不協(xié)調(diào),經(jīng)水面下沉10s后仍不能上浮,且放置平面無(wú)法完成翻正反射)。
　　3.各組處理:A組大鼠不進(jìn)行游泳訓(xùn)練,每天灌胃等量生理鹽水。B組大鼠不進(jìn)行游泳訓(xùn)練,每天灌胃何首烏飲20g/(kg.d)。在制作運(yùn)動(dòng)疲勞模型過(guò)程中,C組、D組、E組和F組大鼠每天下午進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練,其中F組在上午灌胃何首烏飲20g/(kg.d)進(jìn)行

6、預(yù)防,連續(xù)六周。在造模的第42d各組大鼠經(jīng)內(nèi)眥眶后靜脈取血約1.5mL,離心取上清,檢測(cè)血清睪酮、血尿素氮、血乳酸,血漿血紅蛋白和血清肌酐來(lái)判斷造模是否成功。判斷標(biāo)準(zhǔn):與安靜對(duì)照組比較模型組大鼠血清睪酮含量明顯降低;血尿素氮含量和血乳酸濃度明顯升高;血紅蛋白含量降低;血肌酐明顯升高;且大鼠出現(xiàn)食量減少,體重下降,運(yùn)動(dòng)遲緩等現(xiàn)象表明模型已建立成功。在造模成功后,將C組大鼠處死;D組大鼠自由進(jìn)食飲水,不給予任何干預(yù);E組大鼠每天灌胃何首烏飲

7、20g/(kg.d)進(jìn)行治療;F組大鼠停訓(xùn)即停藥,自由進(jìn)食飲水,連續(xù)60天。
　　4.標(biāo)本采集與處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)眼內(nèi)眥眶后靜脈從取血約2ml,1000r/min離心20min,吸取上清液置-80℃低溫冰箱保存待測(cè),然后經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈插管快速灌注預(yù)冷的焦炭酸二乙酯(DEPC)處理的生理鹽水約250ml直到流出的液體變清為止,迅速取出左側(cè)睪丸組織投入液氮,30min后移到-80℃低溫保存

8、,以備用作Westernblotting、RT-PCR測(cè)定。右側(cè)睪丸組織經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定、石蠟包埋以備用作免疫組織化學(xué)染色。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況觀察:安靜對(duì)照組和安靜何首烏飲組大鼠皮毛光潔整齊,活動(dòng)自如,精神狀態(tài)良好。其余四組大鼠普遍精神倦怠,運(yùn)動(dòng)遲緩,反應(yīng)淡漠,皮毛脫落,體型瘦弱,飲食減退,體重下降。
　　2.血清睪酮和血紅蛋白:模型組大鼠與安靜對(duì)照組大鼠相比血清睪酮含量明顯降低,血紅蛋白含量有所降低

9、,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);何首烏飲治療組、預(yù)防組比模型組大鼠血清睪酮含量明顯升高,血紅蛋白含量有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);預(yù)防組大鼠與治療組大鼠相比血清睪酮含量和血紅蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.血乳酸、血肌酐和血清尿素氮:模型組大鼠與安靜對(duì)照組大鼠相比血乳酸濃度,血肌酐含量和血清尿素氮含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);何首烏飲治療組、預(yù)防組大鼠比模型組大鼠血乳酸濃度,

10、血肌酐含量和血清尿素氮含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);預(yù)防組大鼠與治療組大鼠相比血乳酸,血肌酐含量和血清尿素氮無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　4.免疫組織化學(xué)結(jié)果:P450scc免疫組化陽(yáng)性顆粒為棕黃色顆粒主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和精母細(xì)胞胞質(zhì),B組、E組和F組陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)于D組和A組(P<0.05),A組強(qiáng)于C組(P<0.05)。HMG-CoA免疫組化陽(yáng)性顆粒主要表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì),B組和F組表達(dá)最弱,C組最強(qiáng)

11、,與其余各組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STAR和SR-BI免疫組化陽(yáng)性顆粒主要表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì),B組、E組和F組陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)于A組和D組(P<0.05),C組陽(yáng)性信號(hào)最弱。
　　5.Westernblotting和RT-PCR結(jié)果:P450scc蛋白和mRNA表達(dá)變化為:B組、E組和F組明顯高于D組和A組(P<0.05),C組明顯低A組(P<0.05),A組和D組之間沒(méi)有顯著性差異;HMG-CoA蛋白和mRNA表達(dá)變化為:B組和F組明

12、顯低于E組、D組和A組(P<0.05),C組明顯高A組(P<0.05),A組和D組之間沒(méi)有顯著性差異;STAR和SR-BI蛋白和mRNA表達(dá)變化為:E組和F組明顯高于A組和D組(P<0.05),C組明顯低于A組(P<0.05),A組和D組之間沒(méi)有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠模型的建立是成功的。
　　2.何首烏飲能夠提高運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠血清睪酮和血紅蛋白的濃度。
　　3.何首烏飲能夠顯著降低運(yùn)動(dòng)性