表觀遺傳基因?qū)λダ洗笫蟛G丸組織退行性變的作用及何首烏飲干預(yù)機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探討表觀遺傳基因?qū)λダ洗笫蟛G丸組織退行性變的作用及何首烏飲干預(yù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.Wistar雄性大鼠60只，隨機(jī)分為六組：青年對(duì)照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組，每組10只。其中青年對(duì)照組于12月齡處死取材；何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組和懷牛膝組從16月齡開始分別灌胃何首烏飲、何首烏提取液、肉蓯蓉提取液和懷牛膝提取液，自然衰老組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)60 d。取青年對(duì)照

2、組、自然衰老組和何首烏飲組大鼠睪丸組織適量進(jìn)行DNA甲基化芯片檢測(cè)，篩選甲基化差異基因，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。
　　2.采用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測(cè)青年對(duì)照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組及懷牛膝組睪丸組織表觀遺傳基因AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的甲基化水平。
　　3.采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)青年對(duì)照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組及懷牛膝組睪丸組織表

3、觀遺傳基因AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的mRNA表達(dá)水平。
　　4.采用免疫熒光染色技術(shù)觀察青年對(duì)照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組及懷牛膝組睪丸組織溴脫氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.甲基化芯片篩選結(jié)果甲基化芯片共篩選出青年對(duì)照組和自然衰老組的差異甲基化基因共1728個(gè)，其中受何首烏飲直接調(diào)控的差異甲基化基因有23

4、8個(gè)。自然衰老組1176個(gè)基因的甲基化水平較青年對(duì)照組升高，何首烏飲用藥后使其中135個(gè)基因甲基化水平下降；自然衰老組552個(gè)基因甲基化水平較青年對(duì)照組降低，何首烏飲用藥后，使其中103個(gè)基因甲基化水平增加。通過(guò)GO分析和Pathway分析顯示，這238個(gè)基因分布于23條信號(hào)通路上，這些信號(hào)通路與疾病、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞粘附等有關(guān)。
　　2.MSP技術(shù)檢測(cè)AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的甲基化水平 MS

5、P檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與自然衰老組比較，青年對(duì)照組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組AXL、wnt2b、MAPK10甲基化百分比明顯升高（P<0.05），其中肉蓯蓉組、懷牛膝組甲基化百分比明顯低于何首烏飲組（P<0.05），何首烏組與何首烏飲組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；C-myb、Ttc29甲基化百分比明顯降低（P<0.05），其中，何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組甲基化百分比較何首烏飲組明顯升高（P<0.05），青年對(duì)照組與何

6、首烏飲組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的mRNA表達(dá)水平qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與自然衰老組比較，青年對(duì)照組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組wnt2b、MAPK10表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05），AXL、Ttc29、C-myb表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）；和何首烏飲組比較，懷牛膝組Wnt2b表達(dá)水平明顯升高（P

7、<0.05），AXL、Ttc29、C-myb表達(dá)水平明顯下降（P<0.05），青年對(duì)照組與何首烏飲組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.BrdU染色結(jié)果利用免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BrdU陽(yáng)性產(chǎn)物呈紅色斑塊狀或顆粒狀，位于細(xì)胞核內(nèi)。各組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞均位于生精小管基膜附近的精原細(xì)胞內(nèi)。統(tǒng)計(jì)分析表明，和自然衰老組比較，青年對(duì)照組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組生精小管內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.05）；何首烏

8、組、肉蓯蓉組、懷牛膝組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于何首烏飲組（P<0.05），且三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.青年對(duì)照組和自然衰老組共有1728個(gè)差異甲基化基因，其中238個(gè)差異甲基化基因受何首烏飲直接調(diào)控。這238個(gè)基因分布于與疾病、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞粘附等有關(guān)的23條信號(hào)通路上。
　　2.何首烏飲、何首烏提取液、肉蓯蓉提取液、懷牛膝提取液組均可以提高wnt2b、MAPK10和AXL的啟動(dòng)子甲