光譜診斷燒傷創(chuàng)面深度和滲出液含量及納米膜促進(jìn)創(chuàng)面愈合的研究.pdf

1、我國每年因各種原因而引起皮膚燒傷的人數(shù)大約在500萬至1000萬人，燒傷后死亡率、容貌毀損率及致殘率高，患者的救治周期和康復(fù)周期較長，甚至直接威脅患者的生命安全和機(jī)體健康，因此對燒傷創(chuàng)面早期精確的診斷和及時(shí)準(zhǔn)確的治療，顯得尤為重要。
　　對于燒傷的診斷而言，在沒有外在客觀輔助診斷的幫助下，僅憑燒傷臨床表現(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)，燒傷醫(yī)生對燒傷深度的準(zhǔn)確率僅在60％-75％之間，因此近年來對各種輔助診斷技術(shù)的研究層出不窮，包括如B超、MRI、血管顯

2、微鏡、熒光染色、THZ、多光譜等多種技術(shù)手段，但其研究基本都局限于傳統(tǒng)的三度四分法上，并不能精確探測出燒傷皮膚壞死組織的具體深度，傳統(tǒng)的病理檢測可以做到，但因其侵入性操作、會造成永久性創(chuàng)面等原因而不能廣泛用于臨床。迄今為止，尚無公開報(bào)道有相關(guān)技術(shù)用于精確探測燒傷皮膚壞死組織的具體深度。若有一種技術(shù)方法可以對燒傷皮膚壞死組織深度進(jìn)行精確測量，不但能夠?yàn)闊齻疃鹊脑\斷提供一種新的精確的分類方法，而且還能為精確化清創(chuàng)提供客觀參考依據(jù)，大大減小

3、燒傷臨床實(shí)踐的不確定性，在保證清創(chuàng)徹底的同時(shí)盡可能將損傷控制到最低，最大程度的保留皮膚附件及其相關(guān)干細(xì)胞，對提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量，減少疤痕形成具有重要意義。
　　對于燒傷的治療來說，皮膚創(chuàng)面暴露于空氣中后，必須使用敷料覆蓋，作為屏障，起到臨時(shí)的保護(hù)作用。這里面臨兩個問題，一個是對于應(yīng)用于臨床的創(chuàng)面敷料，何時(shí)進(jìn)行更換的問題。燒傷創(chuàng)面換藥一直以來都依賴于臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，大多采用兩天換一次藥的方式進(jìn)行，迄今為止尚沒有一個客觀的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)精確的

4、告訴燒傷醫(yī)生應(yīng)當(dāng)何時(shí)換藥。創(chuàng)面滲出液完全浸透醫(yī)用敷料，是提醒醫(yī)生必須立即換藥的一個明顯標(biāo)志，但若等肉眼都能夠判斷出創(chuàng)面滲出液完全浸透醫(yī)用敷料時(shí)再換藥，那么在換藥之前創(chuàng)面已受感染的風(fēng)險(xiǎn)太高;但若更換敷料太早，則會造成部分醫(yī)療資源和人力資源的浪費(fèi)。因此，如果有種方法能夠在創(chuàng)面滲液足量但是還未能完全浸透敷料的時(shí)刻提醒醫(yī)生換藥，那么就能在控制一定感染風(fēng)險(xiǎn)的前提下盡可能的減少換藥，不但能減少病人的痛苦和負(fù)擔(dān)，還能減少部分人力和醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

5、r>　　另一個問題是，臨床敷料多種多樣，如何選擇和制作新型創(chuàng)面敷料問題。近40年來國內(nèi)外研制開發(fā)了多種創(chuàng)面覆蓋敷料，并廣泛應(yīng)用于臨床。合成類敷料里的組織工程敷料是近年來發(fā)展起來的新一代人工合成類敷料，特別是隨著靜電紡絲技術(shù)地逐步深入研究，靜電紡絲纖維膜敷料發(fā)展成為了新一代的熱點(diǎn)研究的皮膚創(chuàng)面敷料。由于靜電紡絲纖維膜自身特性制約，靜電紡絲纖維膜敷料不含促愈因子，現(xiàn)有公開報(bào)道的研究中在靜電紡絲纖維膜加載促愈因子的敷料不但工藝復(fù)雜且不能緩慢釋

6、放促愈因子，造成材料促愈效果欠佳，臨床轉(zhuǎn)化也有困難。因此若我們能夠通過簡單的方法制作出在靜電紡絲纖維膜上加載緩慢釋放促愈因子的創(chuàng)面敷料，并證明該種材料對創(chuàng)面愈合的影響和機(jī)制，那么我們就可以為臨床選擇和制作此類新型創(chuàng)面敷料提供一種新思路，豐富相關(guān)創(chuàng)面敷料促進(jìn)創(chuàng)面愈合的理論基礎(chǔ)，為下一步臨床轉(zhuǎn)化奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　因此，本研究分為三個部分，第一部分通過對近紅外光譜技術(shù)的運(yùn)用和研究，來精確診斷燒傷創(chuàng)面皮膚壞死組織深度，提高對燒傷創(chuàng)面深度

7、的診斷精度，不僅能為燒傷診斷提供新的更加精確的燒傷分類思路，還能為臨床醫(yī)生判斷燒傷深度提供客觀參考依據(jù)，提高燒傷創(chuàng)面愈合質(zhì)量;第二部分，利用太赫茲射線對醫(yī)用紗布中滲出液含量進(jìn)行精確檢測，以準(zhǔn)確判斷紗布中滲出液的具體含量，為臨床換藥時(shí)機(jī)的選擇提供客觀參考依據(jù)，一定程度上減少患者的痛苦并節(jié)省部分醫(yī)療和人力資源;第三部分，探索VIP-DA-PCL納米纖維膜對在體小鼠創(chuàng)面愈合的影響及相關(guān)機(jī)制，為燒傷創(chuàng)面敷料的選擇和制作提供一種新的思路，豐富同類

8、型敷料促進(jìn)創(chuàng)面愈合的理論基礎(chǔ)，并為下一步臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分、近紅外光譜用于精確診斷燒傷創(chuàng)面壞死組織深度
　　目的:明確燙傷深度與燙傷時(shí)間的關(guān)系;建立原始光譜數(shù)據(jù)與燙傷時(shí)間的對應(yīng)關(guān)系;提取燒傷創(chuàng)面成份信息以及結(jié)構(gòu)信息來表征燒傷皮膚的功能狀態(tài);獲得燒傷深度反演模型以及該模型的準(zhǔn)確率。
　　內(nèi)容和方法:①制作不同燙傷時(shí)間的豬皮燙傷模型，按照燙頭接觸皮膚時(shí)間依次遞增分為九組:5s，10s，20s，30s，40s，

9、60s，80s，100s，120s，每組制作5個樣本。②打開光譜儀調(diào)節(jié)至數(shù)據(jù)采集狀態(tài)。使?fàn)C傷創(chuàng)面與入射光纖保持垂直，光纖探頭距探測表面2cm，對每個樣品表面不同的四個部位進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)采集，并對每個部位多次測量，分類保存。③在采集光譜數(shù)據(jù)后對創(chuàng)面立即取材。進(jìn)行HE染色，經(jīng)組織學(xué)觀察分別測量每個燙傷時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)的具體燙傷深度數(shù)值，每個標(biāo)本測量五次，深度數(shù)值經(jīng)兩位獨(dú)立的病理學(xué)工作者分別測量，取其平均值后得到。④將采集到的光譜信息數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并提

10、取其光學(xué)特性參數(shù)。蒙特卡洛分析提取成份信息（脫氧血紅蛋白，血紅蛋白，水）以及結(jié)構(gòu)信息（散射顆粒的大小和濃度）來表征燒傷皮膚的功能狀態(tài)，構(gòu)成特征參數(shù)集;⑤將得到的光學(xué)特性參數(shù)樣本用于SVM訓(xùn)練，將1557個總樣本分為兩部分，第一部分為總樣本的2/3（1037個樣本），用于構(gòu)建和訓(xùn)練支持向量機(jī)模型，訓(xùn)練方式為交叉檢驗(yàn)法，挖掘出光學(xué)特征與燒傷深度之間的線性或非線性關(guān)系，建立燒傷皮膚組織、成分結(jié)構(gòu)及二者復(fù)合交互項(xiàng)與燒傷深度的復(fù)雜映射關(guān)系模型;然

11、后通過第二部分為總樣本的1/3（520個樣本），用該樣本對模型進(jìn)行10次反演，驗(yàn)證模型的效果并對所建模型的預(yù)測精度進(jìn)行評價(jià)。
　　結(jié)果:①建立了燙傷時(shí)間與燙傷深度之間的線性對應(yīng)模型，在控制燙傷條件下，在1-120s的燙傷時(shí)間內(nèi)，燙傷深度隨燙傷時(shí)間的增加而單調(diào)遞增。通過對標(biāo)準(zhǔn)差的分析可知，模型穩(wěn)定可靠。②得到了原始近紅外光譜數(shù)據(jù)與燙傷時(shí)間的對應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著燙傷時(shí)間的增加，光譜曲線在特定波段（900-1300nm）的光譜幅值隨著燙傷

12、深度的增加逐漸降低，光譜曲線也逐漸趨于平滑。③提取得到含有五個參數(shù)的光學(xué)特征集，各參數(shù)本身有一定的規(guī)律性，但規(guī)律不明顯。④成功利用SVM訓(xùn)練構(gòu)建出燒傷深度反演模型，并對該模型進(jìn)行10次反演，得到的平均相對誤差均值為7.63％，診斷精度在百微米級。
　　小結(jié):近紅外光譜能夠測量得到燒傷皮膚壞死深度數(shù)據(jù)，然后利用蒙特卡洛參數(shù)提取方法和SVM參數(shù)訓(xùn)練的方法能夠構(gòu)建出燒傷深度反演模型，通過該模型能夠從采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)中精確反演出燒傷創(chuàng)

13、面的壞死組織具體深度數(shù)值，并且該模型反演的結(jié)果平均相對誤差均值為7.63％，診斷精度在百微米級。
　　第二部分、太赫茲光譜用于精確診斷紗布中滲出液含量
　　目的:探索太赫茲光譜對紗布的穿透能力，明確太赫茲光譜用于探測紗布中滲出液含量的可行性;測量紗布中三種滲出液的太赫茲光譜，構(gòu)建通過太赫茲光譜數(shù)據(jù)測量紗布中液體含量的模型，證實(shí)太赫茲光譜能夠完成對紗布中滲出液含量的精確診斷。
　　內(nèi)容和方法:①將消毒后的醫(yī)用紗布裁剪為5

14、×5cm大小的方塊，按照紗布層數(shù)依次次遞增的方式分別準(zhǔn)備共18組紗布，紗布層數(shù)從1層到80層，分別測量樣品光和參考光;②通過公式推導(dǎo)并簡化公式，得到THz波透過特性與紗布層數(shù)之間的線性關(guān)系;③準(zhǔn)備新鮮的1000ml豬血液樣品，在樣品中8％的檸檬酸鈉的10ml，取其中的500ml全血作為全血樣本;剩下的500ml全血放入離心機(jī)按照2000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，取其上清做為血漿樣本;再從Milli-Q純水儀中取蒸餾水500ml作為蒸餾水

15、樣本。分別滴加在事先準(zhǔn)備好的大小為5×5cm，層數(shù)為40層的醫(yī)用紗布正中，滴加的液體總含量分別為，蒸餾水:0.1g、0.2g、0.3g、0.5g、0.7g、1g;血漿0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g;全血:0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g;對紗布中滴加的每種液體的每個含量利用太赫茲光譜系統(tǒng)進(jìn)行測量，得到THz時(shí)域光譜圖;④考慮實(shí)際液體蒸發(fā)帶來的對紗布中滴加的液體總含量的影響，通過對紗布同步稱重，修正實(shí)際滴

16、加入紗布中液體含量，并建立實(shí)際遞減液體含量與初始滴加液體含量之間的對應(yīng)關(guān)系，通過簡化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c公式推導(dǎo)，得到紗布中樣品液的總含量mfull與0.3T處THz反射率之間的對應(yīng)模型。
　　結(jié)果:①紗布層數(shù)的增加會帶來太赫茲(THz)波的透過率的衰減和位相延遲的增加，THz波對紗布具有非常好的穿透性，到80層紗布仍然有信號穿過。②隨著紗布中液體含量的增加，THz波的吸收率單調(diào)遞增，三種液體的吸收性質(zhì)不同，因此對應(yīng)的液體擬合曲線的斜率不同

17、，蒸餾水的斜率為0.1518，全血的為0.089，血漿的為0.0684。③測量蒸餾水的敏感度為1.3mg;測量全血的敏感度為0.76mg;測量血漿的敏感度為0.58mg。該結(jié)果的意義為，當(dāng)紗布中蒸餾水的含量改變大于等于1.3mg的時(shí)候，就能被我們搭建的THz-TDS系統(tǒng)檢測到，而用于檢測全血和血漿時(shí)，這個檢測的最小液體變化量分別為0.76mg和0.58mg。
　　小結(jié):太赫茲波對醫(yī)用紗布具有良好的穿透性能，能十分精確的檢測到紗布中

18、三種滲出液（全血、血漿和水）的含量，并且這種水平的檢測敏感度在1.3mg以內(nèi)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于如今臨床仍然通過肉眼和經(jīng)驗(yàn)得到的敏感度。
　　第三部分、VIP-DA-PCL納米纖維膜用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合的研究
　　目的:將加載有血管活性腸肽-多巴胺微球的聚己內(nèi)酯(VIP-DA-PCL)納米纖維膜材料用于在體小鼠創(chuàng)面愈合的研究，明確該材料對創(chuàng)面愈合的影響;通過對創(chuàng)面組織中細(xì)胞增殖標(biāo)志物定位和定量的檢測，以及對血管生成標(biāo)志物的定量檢測，明確該

19、材料對在體細(xì)胞增殖和血管再生的影響。
　　內(nèi)容和方法:①制作小鼠全層皮膚缺損模型，用直徑4毫米打孔器在小鼠背部制作一個直徑4mm的全層皮膚缺損創(chuàng)面。對于不同分組的老鼠分別使用滅菌的凡士林紗布、PCL-DA納米纖維膜和PCL-DA-VIP納米纖維膜分別覆蓋在創(chuàng)面上，并在各組材料表面再覆蓋一層負(fù)壓生物膜固定。以僅覆蓋負(fù)壓生物膜的動物組為對照組。②創(chuàng)面愈合面積測量，我們在小鼠背部打孔手術(shù)后第1、3、5、7天分別對創(chuàng)面進(jìn)行拍照，并用由兩名

20、獨(dú)立的研究人員分別使用軟件IPP6.0對創(chuàng)面的愈合面積進(jìn)行測量，然后取其平均值。③將小鼠在術(shù)后第3天處死，對全層缺損創(chuàng)面組織取材，制作切片并對切片進(jìn)行HE染色后，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照。再生上皮長度，由兩名獨(dú)立的研究者分別進(jìn)行測量，然后取其平均值。④將小鼠在術(shù)后第3天和7天處死，對全層缺損創(chuàng)面組織取材，固定切片后，對切片進(jìn)行馬松三色染色后，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照。肉芽組織厚度，由兩名獨(dú)立的研究者分別進(jìn)行測量，然后取其平均值。⑤我們在打孔

21、術(shù)后第3天用免疫組化檢測了創(chuàng)面的細(xì)胞增殖標(biāo)志物即增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的含量，并在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)。⑥我們通過免疫印跡法(WB)在全層皮膚創(chuàng)面手術(shù)后3天對細(xì)胞增殖標(biāo)記物PCNA、血管生成的標(biāo)志物CD31以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)進(jìn)行了定量檢測。
　　結(jié)果:①創(chuàng)面愈合速度:創(chuàng)面打孔術(shù)后第7天PCL-DA-VIP納米纖維膜組創(chuàng)面愈合速度明顯優(yōu)于其余各組(p＜0.05)。②新生上皮長度:在打孔術(shù)后第3天，PCL-DA納米纖維膜

22、組和PCL-DA-VIP納米纖維膜組的新生表皮長度明顯優(yōu)于對照組和凡士林紗布組(p＜0.05)。然而，在PCL-DA納米纖維膜組和PCL-DA-VIP納米纖維膜組的新生表皮長度之間并未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。③肉芽組織厚度結(jié)果:創(chuàng)面經(jīng)馬松三色染色后在打孔術(shù)后第3天和第7天在PCL-DA-VIP納米纖維膜組的肉芽組織厚度明顯優(yōu)于其余組(p＜0.01)。④細(xì)胞增殖情況:新生表皮中的PCNA的免疫組化染色結(jié)果，在PCL-DA納米纖維膜組和P

23、CL-DA-VIP納米纖維膜組中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組(p＜0.05).然而，在PCL-DA納米纖維膜組和PCL-DA-VIP納米纖維膜組的新生表皮中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量之間并未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。在皮膚全層中的包括新生表皮組織和肉芽組織中的PCNA蛋白免疫印跡結(jié)果中，PCL-DA-VIP納米纖維膜組的PCNA條帶光密度值明顯高于其余組(p＜0.001)。⑤血管再生標(biāo)志物結(jié)果:對創(chuàng)面皮膚全層中的CD31和VEGF進(jìn)行WB

24、檢測，PCL-DA-VIP納米纖維膜組中CD31條帶光密度值明顯高于其余組(p＜0.05).PCL-DA-VIP納米纖維膜組中VEGF條帶光密度值明顯高于對照組和PCL-DA納米纖維膜組(p＜0.05)。然而，凡士林紗布組和PCL-DA-VIP納米纖維膜組的中VEGF含量并未發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　小結(jié):PCL-DA-VIP納米纖維膜能促進(jìn)在體創(chuàng)面的愈合，該膜具有促進(jìn)肉芽組織生長和血管生成的作用，但是對創(chuàng)面的再上皮化無明顯改善作用。<

25、br>　　總體結(jié)論:綜合以上三方面的內(nèi)容，通過在燒傷診斷和治療方面的探索研究，我們得出以下結(jié)論:
　　1.近紅外光譜能夠精確測量燒傷皮膚壞死深度數(shù)值，構(gòu)建的燒傷深度反演該模型平均誤差為7.63％，診斷精度在百微米級。
　　2.太赫茲波對醫(yī)用紗布具有良好的穿透性能，能十分精確的檢測到紗布中三種滲出液（全血、血漿和水）的含量，并且這種水平的檢測敏感度在1.3mg以內(nèi)。
　　3.PCL-DA-VIP納米纖維膜能促進(jìn)在體創(chuàng)面的