2型糖尿病股骨骨折后骨硬化蛋白及WNT信號通路相關性研究.pdf

1、研究背景：
　　高血糖導致的骨折不愈合主要原因是在骨折修復的過程中，高血糖促進軟骨細胞凋亡和破骨細胞分化，減少成骨和軟骨內骨化。以往對骨鈣素、1型膠原氨基端肽(PINP)和Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)的研究主要是針對于糖尿病骨質疏松的研究，尚未有骨硬化蛋白及上述指標在2型糖尿病(Type2 Diabetes Mellitus，T2DM)股骨骨折愈合中相關變化規(guī)律的報道。有發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在骨髓間充質干細胞向成骨細胞

2、分化，及抑制成骨細胞凋亡方面起到積極的作用，但Wnt信號對于T2DM患者骨折修復是否發(fā)揮作用及其作用機制尚未見相關報道。
　　研究目的：
　　1、股骨骨折合并T2DM患者相對于未合并T2DM患者在骨折愈合在急診入院時血液骨代謝指標（骨硬化蛋白、骨鈣素、PINP和β-CTX）的變化情況檢測，通過對結果的分析比較，以確定候選主要參與骨折修復重建的關鍵因子。
　　2、從細胞水平驗證骨硬化蛋白對成骨細胞hFOB1.19干擾后引

3、起的成骨功能變化的規(guī)律，以確定骨硬化蛋白是否具有調節(jié)其余三個骨代謝標志物的作用。
　　3、通過Wnt激動劑和骨硬化蛋白處理hFOB1.19，來檢測骨硬化蛋白是否通過調節(jié)Wnt信號通路上的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）來調節(jié)骨重建的。
　　4、沉默hFOB1.19細胞β-catenin的表達，檢測骨代謝指標骨鈣素、PINP和β-CTX的變化規(guī)律，進一步揭示骨重建可能的調節(jié)機制，為研制治療糖尿病導致的骨不愈合的藥物提供新的藥

4、物治療靶點。
　　方法：
　　隨機選取2014年6月到2015年6月在呼和浩特市第一醫(yī)院骨科就診的股骨骨折伴有T2DM患者32例作為實驗組，同期在該時間段內股骨骨折未合并有糖尿病的患者27例作為對照組，全部患者在急診入院時分別抽取靜脈血液樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)測量骨折修復重建過程中骨鈣素、PINP、β-CTX和骨硬化蛋白的含量變化。對hFOB1.19細胞進行培養(yǎng)，骨硬化蛋白干擾hFOB1.19細胞后，采用qR

5、T-PCR檢測骨鈣素、PINP、β-CTX的mRNA表達量。Wnt激動劑和骨硬化蛋白處理hFOB1.19細胞，采用免疫印跡(Western blot)法檢測β-catenin和磷酸化β-catenin(p-β-catenin)含量變化。利用HiPerFect轉染試劑盒轉染siRNA-β-catenin到hFOB1.19細胞中，Western blot檢測β-catenin蛋白含量變化和qRT-PCR檢測骨鈣素、PINP、β-CTX的mR

6、NA表達的變化。
　　結果：
　　在股骨骨折急診入院患者血清中，T2DM骨硬化蛋白的含量相對于對照組顯著增高，骨鈣素、PINP和β-CTX的含量顯著降低，且骨硬化蛋白與骨鈣素、PINP、β-CTX含量之間為線性負相關。骨硬化蛋白干擾hFOB1.19細胞后，骨鈣素、PINP和β-CTX的mRNA水平均隨著骨硬化蛋白的濃度增高而逐漸降低，呈負相關。Wnt激活劑和骨硬化蛋白干擾hFOB1.19細胞后，胞質中的β-catenin蛋白

7、表達量無顯著性差異，而Wnt激活劑可以下調細胞質中p-β-catenin的水平，骨硬化蛋白可以上調p-β-eatenin的水平，而且骨硬化蛋白濃度越大p-β-catenin上調的水平越高。siRNA-β-catenin轉染后成功干擾hFOB1.19細胞β-catenin的表達，同時使骨鈣素、PINP和β-CTX的mRNA水平顯著降低。
　　結論
　　1、在股骨骨折早期愈合過程中，T2DM骨硬化蛋白的含量相對于對照組顯著增高，

8、骨鈣素、PINP和β-CTX的含量顯著降低，推測骨硬化蛋白可能參與T2DM骨折愈合過程。
　　2、骨硬化蛋白可以下調骨鈣素、PINP和β-CTX的mRNA表達水平，影響骨修復重建的進程。
　　3、骨硬化蛋白可以上調p-β-catenin的水平，而且其濃度越大p-β-catenin上調的水平越高。推測骨硬化蛋白是通過調節(jié)p-β-catenin水平，進而參與調節(jié)骨折修復重建過程的。
　　4、β-catenin表達的下降，可