CtBP參與Polycomb靶基因調(diào)控的作用機(jī)制研究.pdf

1、C-terminal binding proteins(CtBPs)是一類經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄共阻遏因子，在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的形成過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。CtBPs涉及細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生，可能會(huì)成為癌癥研究的重要靶向蛋白之一。Polycomb(Pc)蛋白是Polycomb group(PcG)復(fù)合體中的一員。PcG蛋白作為一類最為重要的轉(zhuǎn)錄阻遏因子之一，也表現(xiàn)出在多細(xì)胞生物的發(fā)育中的核心地位。例如，PeG阻遏

2、Hox基因的表達(dá)對(duì)體節(jié)的形成至關(guān)重要；最近的研究還表明，PcG在胚胎干細(xì)胞的分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。哺乳動(dòng)物的研究表明CtBP可能參與PcG介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，但具體機(jī)制尚不十分清楚。而果蠅體內(nèi)CtBP是否影響Pc的轉(zhuǎn)錄抑制，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本文以果蠅為模式生物，用遺傳學(xué)的方法進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CtBP能拮抗Pc介導(dǎo)的同源異型基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。PcG成員的雜合突變會(huì)產(chǎn)生同源異型轉(zhuǎn)化的表型，即在雄性果蠅的第二及第三對(duì)足

3、上出現(xiàn)多余的性梳，而CtBP突變體本身不具有PcG家族成員突變后導(dǎo)致的同源異型轉(zhuǎn)化的表型。當(dāng)本實(shí)驗(yàn)室在CtBP雜合突變的背景下引入PcG家族成員Pc的雜合突變，卻發(fā)現(xiàn)CtBP雜合突變能減弱了Pc雜合突變所導(dǎo)致的表型，這從遺傳學(xué)的角度上說(shuō)明，CtBP是Pc調(diào)節(jié)同源異型基因轉(zhuǎn)錄抑制的拮抗因子。這個(gè)研究結(jié)果出乎研究者的預(yù)料，因?yàn)楹图棺祫?dòng)物的結(jié)果是相反的。
　　為了探索CtBP拮抗Pc的轉(zhuǎn)錄抑制作用的具體分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室緊接著研究了兩者

4、的相互作用。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)免疫共沉淀以及GST Pull-down的實(shí)驗(yàn)證明了CtBP與Pc存在著相互作用，即表明CtBP對(duì)Pc轉(zhuǎn)錄抑制的拮抗作用可能是通過(guò)它們之間的相互作用所介導(dǎo)的。
　　隨后，本實(shí)驗(yàn)室在細(xì)胞水平進(jìn)行了RNAi實(shí)驗(yàn)，初步探討了CtBP對(duì)Pc介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄阻遏的拮抗作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，Pc對(duì)其靶基因pannier(pnr)和caudal(cad)具有轉(zhuǎn)錄阻遏作用，對(duì)Pc進(jìn)行RNAi可以使pnr和cad的轉(zhuǎn)

5、錄顯著地去阻遏。因此，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)CtBP和Pc同時(shí)進(jìn)行了RNAi干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只干擾CtBP時(shí)，pnr和cad的轉(zhuǎn)錄與Ctrl相同，都受到阻遏；只干擾Pc時(shí)，pnr和cad的轉(zhuǎn)錄會(huì)顯著地去阻遏；而當(dāng)研究者同時(shí)干擾CtBP和Pc時(shí)，pnr和cad的轉(zhuǎn)錄又受到了明顯的阻遏。以上結(jié)果表明：CtBP能拮抗Pc介導(dǎo)的靶基因pnr和Cad的轉(zhuǎn)錄抑制作用。另一方面，當(dāng)CtBP和Pc分別進(jìn)行RNAi干擾后，Pc的靶基因rpr、wg、pnt、h和g

6、t的轉(zhuǎn)錄是受阻遏的，而當(dāng)CtBP和Pc同時(shí)進(jìn)行RNAi干擾之后，rpr、wg、pnt、h和gt的轉(zhuǎn)錄是去阻遏的。說(shuō)明CtBP對(duì)Pc的靶基因的調(diào)節(jié)存在基因特異性。
　　綜上所述，本研究工作發(fā)現(xiàn)了CtBP能拮抗Pc介導(dǎo)的同源異型基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。為了進(jìn)一步探討CtBP拮抗Pc轉(zhuǎn)錄抑制的具體機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室分別在果蠅細(xì)胞水平和體外進(jìn)行了一定的研究。體外蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)則證明了CtBP與Pc之間確實(shí)存在相互作用；果蠅細(xì)胞水平的RNAi干