草魚TGF-β1、Smad4基因真核過表達(dá)和RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及其活性驗證.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idella)是目前全球最大的淡水養(yǎng)殖品種，僅在國內(nèi)年產(chǎn)量就4百余萬噸，它不僅是世界上發(fā)達(dá)地區(qū)和欠發(fā)達(dá)地區(qū)廉價蛋白的主要來源，同時也為優(yōu)質(zhì)動物蛋白的供應(yīng)做出了巨大貢獻(xiàn)［1］。關(guān)于草魚營養(yǎng)學(xué)研究也早已開始，針對目前的研究現(xiàn)狀我們也做了一些營養(yǎng)調(diào)控機理方面的探索，先前有學(xué)者在研究工作中發(fā)現(xiàn)攝食蠶豆的草魚肌肉硬度顯著增加而深受消費者歡迎［2］；有研究顯示魚類肌肉硬度的增加與Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)有顯著相關(guān)性

2、［3］，而Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)受TGF-β1/Smad4信號通路調(diào)控［4］；為了探究草魚肌肉品質(zhì)改良的營養(yǎng)調(diào)控機制，本文主要構(gòu)建了草魚TGF-β1/Smad4信號通路關(guān)鍵信號因子TGF-β1和Smad4基因的真核過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TGF-β1和pcDNA3.1(+)-Smad4和RNA干擾表達(dá)載體pRNA-6.1/Neo-TGF-β1（Ⅰ）、pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅱ)、pRNA-6.1/Neo-TGF-β

3、1(Ⅲ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅰ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅲ)，隨后分別在細(xì)胞和魚體水平驗證構(gòu)建的過表達(dá)和RNA干擾表達(dá)載體的活性，企圖為后續(xù)研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將本文主要實驗內(nèi)容概括如下：
　　1、本文首先克隆了草魚TGF-β1、Smad4基因開放閱讀框（ORF，Open Reading Frame）序列各1134 bp、1644 bp。其次，在

4、TGF-β1、Smad4序列兩端分別加上相應(yīng)的酶切位點，同時對pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體進行雙酶切，將帶酶切位點的片段正向插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建TGF-β1、Smad4基因的真核過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TGF-β1、pcDNA3.1(+)-Smad4.另一方面，根據(jù)TGF-β1、Smad4基因序列全長分別設(shè)計3對長度為48 bp的shRNA，然后將構(gòu)建好的shRNA插入到載體pRNA-U6.1

5、/Neo中，即成功構(gòu)建TGF-β1、Smad4基因的RNA干擾表達(dá)載體pRNA-6.1/Neo-TGF-β1（Ⅰ）、pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅱ)、pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅲ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅰ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅲ)。本文構(gòu)建成功的草魚TGF-β1、Smad4基因的RNA干擾表達(dá)載體和真核過表達(dá)載體，可為下一步草魚肌

6、肉發(fā)育過程中TGF-β1/smad4信號通路作用的研究奠定基礎(chǔ)。
　　2、為在細(xì)胞水平上進一步檢測構(gòu)建的過表達(dá)和RNA干擾表達(dá)載體的有效性，本文首先進行了草魚成纖維細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)，因分離后的草魚成纖維細(xì)胞未能形成穩(wěn)定細(xì)胞系，隨后將過表達(dá)載體和干擾載體轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定的斑馬魚 ZF4細(xì)胞系；因轉(zhuǎn)染效果不佳，后期針對不同物種做了相關(guān)的生物信息學(xué)分析（包括蛋白結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列同源性比對），同源性比對結(jié)果顯示人與草魚蛋白序列同源性高達(dá)百

7、分之九十以上；隨后將過表達(dá)載體和RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞做進一步驗證實驗，轉(zhuǎn)染36h（轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80％）后熒光定量檢測TGF-β1、Smad4和Ⅰ型膠原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）基因的相對表達(dá)量；結(jié)果顯示，過表達(dá)實驗組草魚TGF-β1、Smad4及Ⅰ型膠原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）基因的表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），對人TGF-β1、Smad4和Ⅰ型膠原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）

8、基因的檢測結(jié)果顯示無顯著差異；RNA干擾實驗組相比于對照組Ⅰ型膠原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）及TGF-β1、Smad4基因的表達(dá)量較對照組顯著降低（ P＜0.05）且鑒定出 pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅲ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)的干擾效果最好.本實驗已在細(xì)胞水平上很好的驗證了表達(dá)載體的有效性。
　　3、本文在魚體水平又進一步的檢測了TGF-β1、Smad4基因過表達(dá)和RNA干擾表達(dá)載體

9、的活性，結(jié)果顯示過表達(dá)實驗組36h和48h目的基因相對表達(dá)量顯著高于對照組；RNA干擾表達(dá)載體 pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅲ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)36h均有一定的干擾效果但效果不顯著,48h表達(dá)量急劇上升，魚體水平的結(jié)果也說明了過表達(dá)載體的活性很高，RNA干擾表達(dá)載體有一定活性但活性較低；本實驗在魚體水平也較好的驗證了TGF-β1和Smad4基因過表達(dá)載體和RNA干擾表達(dá)載體的活性。
　　本實