骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠腦出血及調(diào)控自噬流和軸突再生的機(jī)制研究.pdf

1、腦出血(intracerebral hematoma，ICH)作為神經(jīng)外科最常見的疾病之一，是現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康的殺手。雖然神經(jīng)外科血腫清除手術(shù)可以作為挽救 ICH患者生命的一項(xiàng)主要的治療措施，但是患者術(shù)后仍然會(huì)保留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，讓其最終難以回歸社會(huì)。ICH后受損腦組織內(nèi)皮質(zhì)脊髓束的修復(fù)和重塑是促進(jìn)患者肢體運(yùn)動(dòng)障礙恢復(fù)的解剖病理學(xué)基礎(chǔ)，而軸突的斷裂和損傷會(huì)直接影響皮質(zhì)脊髓束的功能。雖然受損死亡后的神經(jīng)元幾乎不能再生，但是神經(jīng)

2、元軸突卻可以表現(xiàn)出一定的再生能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是從骨髓中分離出的一種中胚層來源的多潛能干細(xì)胞，其具備體外擴(kuò)增的能力，不僅能夠分化成為中胚層起源的脂肪、骨和軟骨等組織，而且亦可以分化為內(nèi)外胚層來源的血管內(nèi)皮及神經(jīng)等組織。BMSCs具有較好的增殖能力，易于分離培養(yǎng)，自體移植無免疫源性，不受倫理學(xué)限制，越來越多的被應(yīng)用于急性腦損傷相關(guān)疾病治

3、療相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中。目前體外模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已有BMSCs移植能夠促進(jìn)軸突再生的報(bào)道。自噬是指通過對蛋白質(zhì)聚集體及受損細(xì)胞器的降解以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定細(xì)胞代謝過程，目前已證實(shí)了 ICH能夠?qū)е伦允傻募せ睢＝谟醒芯堪l(fā)現(xiàn)皮質(zhì)神經(jīng)元自噬水平的增強(qiáng)促進(jìn)了軸突的再生，減少了軸縮球的形成。在全面檢索文獻(xiàn)和前期工作基礎(chǔ)上，我們推測BMSCs移植能夠有效改善ICH大鼠的神經(jīng)功能障礙，促進(jìn)軸突再生，機(jī)制可能與PI3K-Akt-mTOR通路介導(dǎo)的自噬流增強(qiáng)有關(guān)。

4、為證明此假說，本課題將分以下三部分進(jìn)行詳細(xì)闡述。
　　第一部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的：證實(shí)大鼠ICH后BMSCs移植能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善神經(jīng)功能障礙。
　　方法：將98只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為三組：1）假手術(shù)組（Sham group）；2）腦出血組（ICH group）；3）腦出血+BMSCs移植組（BMSCs group）。分離和培養(yǎng)3周齡雄性SD大鼠BMSCs至第三代，流

5、式細(xì)胞儀對BMSCs表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。采用注血法復(fù)制SD雌性大鼠ICH模型，將2μL濃度為1×108/mL的BMSCs懸液于造模后1小時(shí)經(jīng)腦室注入，檢測如下指標(biāo)：1）HE染色觀察術(shù)后3天不同組別受損腦組織的病理變化和細(xì)胞存活狀態(tài)；2）免疫熒光檢測造模手術(shù)前及術(shù)后12小時(shí)-7天Sry陽性細(xì)胞在血腫周圍受損腦組織內(nèi)的分布；3）TUNEL染色顯示術(shù)后1-7天不同組別受損腦組織細(xì)胞凋亡；4）腦組織含水量測定顯示1-7天受損腦組織水腫情況；5）

6、于造模手術(shù)前及術(shù)后12小時(shí)-7天進(jìn)行前置放置實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)和NSS評分，檢測大鼠神經(jīng)功能障礙的變化。應(yīng)用Image Lab5.1及Image J等分析系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測定分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果寫成均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0分析，P＜0.05則差異具有統(tǒng)計(jì)意義。
　　結(jié)果：
　　1.BMSCs形態(tài)學(xué)觀察：接種后一天，原代BMSCs慢慢貼壁。BMSCs核居中，胞體較小，形狀為均和的圓形或者梭形，折光性比較強(qiáng)，增殖方

7、式為散在的克隆增殖。待生長抑制期度過后，細(xì)胞平行排列呈現(xiàn)快速的漩渦狀聚集生長。之后細(xì)胞形態(tài)隨著傳代變的更加均勻，形狀多為梭形；
　　2.流式細(xì)胞儀對 BMSCs表面標(biāo)記物的鑒定結(jié)果：我們將第三代BMSCs進(jìn)行表面標(biāo)記物的鑒定，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示BMSCs的CD106陽性表達(dá)率為74.56％，CD29陽性表達(dá)率為76.11%，CD106和CD29呈陽性表達(dá)。CD54陽性表達(dá)率為5.05%，CD45陽性表達(dá)率為3.88%，CD54和C

8、D45呈陰性表達(dá)；
　　3.大鼠ICH模型的制備情況：大體觀察 ICH大鼠腦組織可見造模手術(shù)的注射點(diǎn)，位于尾狀核正上方。選擇注射點(diǎn)所在平面橫切大鼠腦組織，能夠觀察到血腫位于基底節(jié)區(qū)，周圍有局部腦組織損傷，腦室內(nèi)出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血亦可見。HE染色顯示Sham組大鼠腦組織具有正常的組織形態(tài)，細(xì)胞間隙正常，神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)有序的排列，胞核形狀均勻規(guī)則。ICH組細(xì)胞間隙增加，血腫周邊受損腦組織可見明顯水腫，神經(jīng)細(xì)胞胞體皺縮，胞漿嗜酸性減弱，

9、細(xì)胞核固縮。BMSCs組受損腦組織形態(tài)改變基本如同IC H組，但周邊組織水腫較輕，變性、壞死的神經(jīng)細(xì)胞明顯較少；
　　4.BMSCs在血腫周圍受損腦組織內(nèi)的分布：BMSCs移植前，免疫熒光結(jié)果顯示無雄鼠來源的Sry陽性細(xì)胞。12小時(shí)，Sry蛋白在BMSCs胞核中呈顆粒狀表達(dá)。之后陽性細(xì)胞數(shù)呈逐漸增多的趨勢，于移植后3天達(dá)到峰值。直至14天時(shí)血腫周圍受損腦組織內(nèi)仍可見Sry陽性細(xì)胞；
　　5.TUNEL染色檢測結(jié)果：Sham組

10、間或可見TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)，零星分布，著色淺淡。ICH組1-7天TUNEL陽性細(xì)胞簇狀出現(xiàn)，其陽性細(xì)胞積分光密度值高于Sham組，差異顯著（P＜0.05）。BMSCs組TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)趨勢與ICH組類似，但積分光密度值與ICH組相比顯著降低（P＜0.05）。
　　6.腦組織含水量測定：Sham組腦組織含水量無明顯變化。ICH組與Sham組相比，在造模術(shù)后1,3和7天的腦組織含水量均顯著升高（P＜0.05）。BMSCs組

11、大鼠1,3和7天的腦組織含水量均低于ICH組，差異顯著（P＜0.05）。
　　7.ICH后神經(jīng)功能障礙的評估：ICH導(dǎo)致了大鼠嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。BMSCs組大鼠在術(shù)后第3，7和14天的前肢放置率、轉(zhuǎn)角率均顯著高于ICH組（P＜0.05），而NSS評分則顯著低于ICH組（P＜0.05）。
　　小結(jié)：BMSCs的原代培養(yǎng)、傳代和鑒定；采用注血法成功建立了大鼠ICH模型；大鼠ICH后血腫周圍腦組織受損，導(dǎo)致ICH大鼠神經(jīng)功能障礙

12、；給予BMSCs移植治療后，可以發(fā)揮一定神經(jīng)保護(hù)作用，減輕血腫周圍腦組織受損程度，改善腦水腫和ICH大鼠神經(jīng)功能障礙情況。
　　第二部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植通過PI3K-Akt-mTOR通路對腦出血大鼠自噬和軸突再生的影響
　　目的：通過PI3K-Akt-mTOR通路抑制劑LY294002的干預(yù)，探討大鼠ICH后BMSCs移植能否通過PI3K-Akt-mTOR通路影響受損腦組織內(nèi)的自噬和軸突再生。
　　方法：102只

13、雌性 SD大鼠被隨機(jī)分為四組：1）假手術(shù)組（Sham group）；2）腦出血組（ICH group）；3）腦出血+BMSCs移植組（BMSCs group）；4）腦出血+BMSCs移植+LY294002干預(yù)組（LY294002 group）。動(dòng)物模型制作及BMSCs移植同第一部分，取術(shù)后12小時(shí)、1天、3天、7天、14天5個(gè)時(shí)間對下列指標(biāo)進(jìn)行檢測：1）透射電鏡觀察大鼠ICH后受損腦組織超微結(jié)構(gòu)，檢測自噬體；2）Western-blot

14、檢測 ICH后受損腦組織軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43和SCG10，自噬相關(guān)蛋白LC3和p62，通路蛋白 p-Akt的表達(dá)；3）免疫組化檢測受損腦組織內(nèi) GAP-43的表達(dá)及定位；4）免疫熒光觀察受損腦組織內(nèi)p-Akt和mTOR的共聚焦結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定記錄及統(tǒng)計(jì)分析同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.透射電鏡結(jié)果：ICH造模術(shù)后3天，在皺縮的神經(jīng)細(xì)胞的胞核四周可以觀察到許多腫脹及變形的線粒體，此時(shí)亦有受損的線粒體及其他細(xì)胞結(jié)

15、構(gòu)被雙層膜樣結(jié)構(gòu)所環(huán)繞，它們進(jìn)入溶酶體中并與之融合，最終形成了自噬溶酶體；
　　2.p-Akt的免疫印跡分析結(jié)果：Sham組p-Akt蛋白低表達(dá)。ICH組大鼠受損腦組織內(nèi)p-Akt在造模手術(shù)后12小時(shí)升高，至3天達(dá)到峰值，之后逐漸降低，在各時(shí)間點(diǎn)p-Akt與Akt的比值都高于Sham組（P＜0.05）。BMSCs組p-Akt變化趨勢與ICH組類似，但各時(shí)間點(diǎn)p-Akt與Akt的比值進(jìn)一步升高（P＜0.05）。而 LY294002組

16、與 BMSCs組相比 p-Akt與Akt的比值降低，差異顯著（P＜0.05）；
　　3.p-Akt（紅色熒光）和mTOR（綠色熒光）的免疫熒光共聚焦結(jié)果：Sham組紅色和綠色熒光表達(dá)較少，重疊后可見少量的黃色聚集。ICH組造模后3天血腫周圍受損腦組織內(nèi)可見比Sham組中略強(qiáng)的紅色及綠色熒光，重疊后呈橘黃色。BMSCs組紅色及綠色熒光比ICH組更強(qiáng)，重疊后橘黃色加重。而經(jīng)PI3K-Akt-mTOR通路抑制劑LY294002干預(yù)后，紅

17、色及綠色熒光較BMSCs組明顯減弱，重疊后的橘黃色熒光亦減弱；
　　4.LC3的免疫印跡分析結(jié)果：Sham組LC3II蛋白低表達(dá)。ICH組受損腦組織內(nèi)LC3II與LC3I的比值于術(shù)后12小時(shí)升高，3天達(dá)到峰值，之后降低但仍高于Sham組（P＜0.05）。BMSCs組LC3II與LC3I比值的變化趨勢與ICH組類似，但其表達(dá)量與ICH組相比較有進(jìn)一步升高，差異顯著（P＜0.05）。而與BMSCs組相比，LY294002干預(yù)能明顯降低

18、LC3II與LC3I的比值（P＜0.05）；
　　5.p62的免疫印跡分析結(jié)果：Sham組p62的蛋白表達(dá)未見明顯差異。IC H組術(shù)后1天受損腦組織內(nèi)p62表達(dá)降低，3天達(dá)到最低值，雖然之后表達(dá)稍有升高，但仍低于Sham組，差異顯著（P＜0.05）。BMSCs組p62表達(dá)的趨勢類似ICH組，但其在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均明顯低于ICH組（P＜0.05）。但LY294002干預(yù)后，p62的表達(dá)強(qiáng)度與BMSCs組相比明顯升高（P＜0.05）

19、；
　　6.GAP-43免疫組化檢測結(jié)果：Sham組間或可見零星分布GAP-43的陽性細(xì)胞的表達(dá)。ICH組在術(shù)后1-7天可見GAP-43陽性細(xì)胞明顯增加，免疫反應(yīng)性與Sham組相比顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。BMSCs組3-7天GAP-43陽性細(xì)胞的免疫反應(yīng)性與ICH組比較進(jìn)一步增強(qiáng)，差異顯著（P＜0.05）。而LY294002干預(yù)導(dǎo)致GAP-43陽性細(xì)胞的免疫反應(yīng)性與BMSCs組相比明顯降低（P＜0.05）；
　　7.GAP

20、-43的免疫印跡分析結(jié)果：Sham組GAP-43的蛋白表達(dá)未見明顯差異。ICH組造模術(shù)后3天受損腦組織GAP-43表達(dá)升高，雖然7天和14天GAP-43稍有降低，但仍高于Sham組，差異顯著（P＜0.05）。BMSCs組GAP-43的表達(dá)趨勢類似ICH組，但其在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均進(jìn)一步升高（P＜0.05）。而LY294002干預(yù)后，GAP-43的表達(dá)強(qiáng)度與BMSCs組相比明顯降低（P＜0.05）；
　　8.SCG10的免疫印跡分析

21、結(jié)果：Sham組SCG10的蛋白表達(dá)未見明顯差異。ICH組受損腦組織內(nèi)SCG10于造模術(shù)后12小時(shí)升高，3天達(dá)峰值，之后逐漸降低但仍高于Sham組（P＜0.05）。BMSCs組SCG10的表達(dá)趨勢與ICH組類似，但其在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均降低，差異顯著（P＜0.05）。而LY294002干預(yù)后與BMSCs組相比能明顯提高SCG10的表達(dá)強(qiáng)度（P＜0.05）。
　　小結(jié)：ICH后血腫周圍受損腦組織內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞存在自噬和PI3K-Akt

22、-mTOR通路的激活；給予BMSCs移植治療后，PI3K-Akt-mTOR通路進(jìn)一步激活，血腫周圍受損腦組織內(nèi)的自噬流增加，同時(shí)軸突再生增強(qiáng)；而 BMSCs移植對自噬流強(qiáng)度和軸突再生相關(guān)蛋白的表達(dá)均受PI3K-Akt-mTOR信號通路的調(diào)控。
　　第三部分：大鼠腦出血后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植通過自噬流介導(dǎo)軸突再生的機(jī)制研究
　　目的：通過自噬抑制劑3MA和自噬激活劑雷帕霉素（Rapamycin， RAPA）的干預(yù)，明確大鼠IC

23、H后BMSCs移植是否通過促進(jìn)血腫周圍受損腦組織內(nèi)的自噬流介導(dǎo)了軸突再生。
　　方法：45只雌性SD大鼠被隨機(jī)分為五組：1）假手術(shù)組（Sham group）；2）腦出血組（ICH group）；3）腦出血+BMSCs移植組（BMSCs group）；4）腦出血+BMSCs移植+3-MA干預(yù)組（3MA group）；5）腦出血+BMSCs移植+RAPA干預(yù)組（RAPA group）。在術(shù)后3天對下列指標(biāo)進(jìn)行檢測：1）免疫熒光觀察受損

24、腦組織內(nèi)LC3和不同細(xì)胞標(biāo)記物的共聚焦情況；2）Western-blot檢測ICH后受損腦組織軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43和SCG10，自噬相關(guān)蛋白LC3和p62，通路蛋白p-Akt的表達(dá)；3）免疫組化檢測受損腦組織內(nèi)GAP-43的表達(dá)及定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定記錄及統(tǒng)計(jì)分析同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.LC3和細(xì)胞標(biāo)記物的免疫熒光共聚焦結(jié)果：紅色熒光標(biāo)記LC3，綠色熒光標(biāo)記神經(jīng)元，洋紅色熒光標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)

25、胞核。Sham組紅色熒光表達(dá)較少，能與綠色熒光重疊，可見少量的橘黃色聚集。ICH組受損腦組織內(nèi)胞漿中可見比Sham組多的紅色熒光，而綠色熒光明顯減少，重疊后呈橘黃色，提示 ICH后神經(jīng)細(xì)胞自噬。同時(shí)洋紅色熒光要多于Sham組，提示ICH后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。BMSCs組紅色及綠色熒光均比ICH組更多，重疊后橘黃色加重，提示BMSCs移植治療進(jìn)一步激活了神經(jīng)細(xì)胞自噬，也減少了神經(jīng)細(xì)胞的死亡。同時(shí)洋紅色熒光少于ICH組，提示BMSCs能抑制I

26、CH后的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。經(jīng)自噬抑制劑3MA干預(yù)后，與BMSCs組相比紅色熒光減少，而綠色熒光略減少，重疊后橘黃色亦減弱，洋紅色熒光無顯著變化。經(jīng)自噬激活劑RAPA干預(yù)后，與BMSCs組相比紅色熒光顯著增強(qiáng)，而綠色熒光無顯著變化，重疊后橘黃色加重明顯，洋紅色熒光亦無顯著變化；
　　2.自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的免疫印跡分析結(jié)果：ICH大鼠受損腦組織內(nèi)LC3II與LC3I比值顯著高于Sham組（P＜0.05），而p62表達(dá)顯著低于

27、Sham組（P＜0.05），提示ICH后自噬流的激活。BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步升高LC3II與LC3I比值（P＜0.05），而p62表達(dá)量進(jìn)一步降低（P＜0.05），提示BMSCs能夠增強(qiáng)自噬流。當(dāng)給予自噬抑制劑3MA干預(yù)后，自噬被抑制，LC3II與LC3I比值降低（P＜0.05），而p62表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。自噬激活劑RAPA具有相反的作用，導(dǎo)致了LC3II與LC3I比值再一次升高（P＜0.05），p62表達(dá)則再一次降低（P

28、＜0.05）；
　　3.軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43和SCG10的免疫印跡分析結(jié)果：ICH大鼠受損腦組織內(nèi)GAP-43和SCG10表達(dá)均高于Sham組（P＜0.05）。BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步升高GAP-43的表達(dá)（P＜0.05），而SCG10表達(dá)降低（P＜0.05）。當(dāng)給予自噬抑制劑3MA干預(yù)后，GAP-43的表達(dá)降低（P＜0.05），而SCG10表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。自噬激活劑RAPA具有相反的作用，導(dǎo)致了GAP-43

29、表達(dá)再次升高（P＜0.05），而SCG10表達(dá)則進(jìn)一步降低（P＜0.05）；
　　4. GAP-43的免疫組化檢測結(jié)果：Sham組可見零星分布的陽性細(xì)胞的表達(dá)，著色很淡。ICH大鼠受損腦組織內(nèi)可見GAP-43陽性細(xì)胞明顯增加，著色亦加深，免疫反應(yīng)性與Sham組相比顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。經(jīng)BMSCs移植治療后GAP-43陽性細(xì)胞進(jìn)一步增加，免疫反應(yīng)性進(jìn)一步增強(qiáng)，差異顯著（P＜0.05）。自噬抑制劑3MA干預(yù)后，與BMSCs組比較

30、GAP-43陽性細(xì)胞免疫性降低（P＜0.05），而自噬激活劑RAPA對GAP-43陽性細(xì)胞無顯著影響；
　　5.p-Akt的免疫印跡分析結(jié)果：造模術(shù)后3天，ICH組p-Akt與Akt的比值顯著高于Sham組（P＜0.05），而BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步升高p-Akt與Akt的比值（P＜0.05）。然而，自噬抑制劑3MA和自噬激活劑RAPA對p-Akt與Akt的比值無顯著影響。
　　小結(jié)：大鼠ICH后BMSCs移植可通過增強(qiáng)