骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞自噬改善哮喘的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探索樹(shù)突狀細(xì)胞的自噬與哮喘發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，并進(jìn)一步研究BMMSCs對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的自噬與功能的影響。
　　方法:
　　一、首先明確哮喘模型肺源DCs自噬水平的高低;
　　將BALB/c小鼠分為急性哮喘組和空白對(duì)照組:哮喘組利用卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)建立小鼠過(guò)敏性哮喘模型。H-E染色觀察各組小鼠肺組織的病理改變，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組小鼠血清OVA特異性IgE、BALF的IL4/

2、13因子的表達(dá)水平、肺DCs自噬水平。
　　二、深入探索調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的自噬對(duì)哮喘的影響:
　　1、將BALB/c小鼠分為3組:急性哮喘組（哮喘組）、哮喘自噬抑制劑CQ治療組（CQ組）和空白對(duì)照組（對(duì)照組），其中哮喘組和CQ組利用卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)建立小鼠過(guò)敏性哮喘模型，CQ組加用自噬抑制劑氯喹(CQ)進(jìn)行激發(fā)前干預(yù)。H-E染色觀察各組小鼠肺組織的病理改變，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)各組小鼠血清

3、OVA特異性IgE、肺DCs自噬水平及表面共刺激分子、MHCⅡ的表達(dá)水平。
　　2、體外用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3MA)抑制C57/B6小鼠骨髓源DCs自噬，檢測(cè)DCs表面共刺激分子、MHCⅡ的表達(dá)。
　　3、獲取OT2小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞，與各組DCs以1∶10的比例混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況與活化反應(yīng)。
　　三、進(jìn)一步探討B(tài)MMSCs對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的自噬與功能的影響:
　　1、BALB/c小

4、鼠分為空白對(duì)照組、哮喘組、MSCs細(xì)胞治療組（MSC組）3組，其中哮喘組和MSC組利用卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)建立小鼠過(guò)敏性哮喘模型，MSC組于激發(fā)前一天尾靜脈注射MSCs細(xì)胞混懸液。H-E染色觀察各組小鼠肺組織的病理改變，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組小鼠血清OVA特異性IgE、肺泡灌洗液的IL4/13因子的表達(dá)水平。
　　2、骨髓來(lái)源的DCs分為對(duì)照組（CON組）、LPS預(yù)處理DCs組（LPS-DC組）及MSCs與DCs共培養(yǎng)組（

5、MSC-DC組），再分別收取各組DCs后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面CD40、CD86、MHCⅡ表達(dá)水平體，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組DCs自噬水平。
　　3、獲取OT2小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞，與各組DCs以1∶10的比例混勻，流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　一、哮喘小鼠肺DCs自噬水平升高:
　　1、哮喘組小鼠肺炎浸潤(rùn)明顯，血清OVA特異性IgE水平、BALF IL-4和IL-13因子水平高于對(duì)

6、照組（P均＜0.05）;
　　2、哮喘組肺DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均高于對(duì)照組，哮喘組肺DCs自噬水平比對(duì)照組升高明顯。
　　二、抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的自噬改善哮喘病情:
　　1、哮喘組小鼠血清OVA特異性IgE水平高于對(duì)照組(P＜0.05)，而CQ組血清OVA特異性IgE水平較哮喘組降低(P＜0.05);
　　2、HE染色:哮喘組小鼠血管周圍及細(xì)支氣管有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡的間隔有增寬及斷

7、裂，炎癥浸潤(rùn)多于對(duì)照組;而與哮喘組相比，CQ組血管和支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少;
　　3、自噬的檢測(cè):哮喘組肺DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均高于對(duì)照組;而較于哮喘組，CQ組肺DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均降低，說(shuō)明哮喘組肺DCs自噬比對(duì)照組高，而CQ組肺DCs的自噬較哮喘組下降;
　　4、相比對(duì)照組，哮喘組肺DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ均升高(P＜0.05); CQ

8、組與哮喘組相比CD86及MHCⅡ均降低(P＜0.05)，CD80也有下降趨勢(shì)(P＞0.05);
　　5、與對(duì)照組相比，OVA組DCs表面共刺激分子CD40、CD86及MHCⅡ均升高(P＜0.05)，3MA組與OVA組相比CD86及MHCⅡ均降低(P＜0.05)，CD40也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P＞0.05);
　　6、相較于對(duì)照組，哮喘組肺DCs誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞增殖增加(P＜0.05)，而CQ組與哮喘組相比肺DCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞增

9、殖降低(P＜0.05)，說(shuō)明抑制DCs自噬能降低DCs誘導(dǎo)的OT2小鼠T細(xì)胞的增殖能力;
　　7、哮喘組T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P＜0.05)，而CQ組T細(xì)胞CD69比哮喘組低(P＜0.05)，說(shuō)明自噬抑制劑可以降低T細(xì)胞活化反應(yīng)
　　三、BMMSCs抑制DCs的自噬與功能，并改善哮喘:
　　1、哮喘組小鼠血清OVA特異性IgE水平高于對(duì)照組(P＜0.05)，而MSC組血清OVA特異性IgE水平較哮喘組降低

10、(P＜0.05);
　　2、HE染色:哮喘組小鼠肺有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡間隔有增寬及斷裂，炎癥浸潤(rùn)多于對(duì)照組;而與哮喘組相比，MSC組肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少;
　　3、哮喘組BALF中IL-4和IL-13因子的量比對(duì)照組要高(P＜0.05)，哮喘MSCs治療組BALF中IL-4和IL-13因子比哮喘組下降(P＜0.05);
　　4、自噬的檢測(cè):LPS-DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均高于對(duì)照組(

11、P＜0.05);而較于LPS-DCs組，MSC-DCs的LC3Ⅱ/Ⅰ及LC3Ⅱ/ACTIN比率均降低(P＜0.05)，說(shuō)明MSC-DCs的自噬較LPS-DCs組下降;
　　5、MSC-DCs組與LPS-DCs相比，表面分子CD40及MHCⅡ均降低(P＜0.05);
　　6、LPS-DCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖增加，而MSC-DC組與LPS-DCs組相比誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖降低，說(shuō)明MSCs能降低DCs誘導(dǎo)的OT2小鼠T細(xì)胞的增殖能力。