IGF1R信號通路在心外膜祖細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究.pdf

1、心外膜祖細(xì)胞被證實在心臟發(fā)育過程中起著重要作用，它能通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）形成心外膜來源細(xì)胞（EPDCs），并在一系列的信號通路作用下最終分化為心臟成纖維細(xì)胞以及冠脈血管平滑肌細(xì)胞，參與心臟纖維骨架和冠脈血管的形成。因其具有多項分化潛能，心外膜祖細(xì)胞被認(rèn)為是心臟的第三心生區(qū)，是一個能特征性表達(dá)Tbx18、Wt1和Tcf21等基因的祖細(xì)胞池。成年心臟的心外膜細(xì)胞喪失心外膜祖細(xì)胞的特征，但有研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后梗死區(qū)周邊處于靜止期的心外膜

2、細(xì)胞可再次激活，重新表達(dá)胚胎期心外膜祖細(xì)胞基因，如Tbx18和Wt1，并不斷增殖、EMT、遷移進(jìn)入梗死區(qū)域參與心臟修復(fù)及血管再生。因此，研究心外膜祖細(xì)胞增殖以及EMT機制不僅對于深入探索心臟生長發(fā)育機制具有重要的意義，且有助于推進(jìn)心外膜祖細(xì)胞在心臟再生領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用。胰島素樣生長因子1型受體（IGF1R）介導(dǎo)的信號通路已經(jīng)被證實參與多種細(xì)胞的增殖以及EMT過程，并且有研究通過原位雜交的方式證實在E11.5-E14.5天心外膜上有IGF1

3、R基因的表達(dá)，我們猜測此信號通路可能參與調(diào)控心外膜祖細(xì)胞的增殖以及EMT過程。IGF1R參與調(diào)控細(xì)胞增殖以及EMT的作用除了通過傳統(tǒng)經(jīng)典的PI3K/AKT以及MAPK/ERK途徑實現(xiàn)外，近年來發(fā)現(xiàn)其也可通過FAK途徑產(chǎn)生相似的生理或者病理作用，因此，我們通過本實驗研究探索IGF1R信號通路在心外膜祖細(xì)胞增殖以及EMT中的作用，以及探討其相關(guān)作用是否通過FAK介導(dǎo)實現(xiàn)。
　　第一部分、IGF1R信號通路在小鼠胚胎心臟組織中的時空表達(dá)

4、
　　目的：探索IGF1R及其主要配體IGF1和IGF2在小鼠胚胎心臟組織中的時空表達(dá)情況。
　　方法：雌性及雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行交配，取E11.5-E17.5天的胚胎組織進(jìn)行冰凍切片，免疫熒光染色確定IGF1R及其配體IGF1和IGF2在E11.5-E17.5天胚胎心臟中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：免疫熒光染色結(jié)果提示IGF1R在E11.5-E17.5天的胚胎心外膜上有明確表達(dá)。IGF1在E11.5-E13.5天的

5、胚胎心外膜上表達(dá)量較少，在E14.5-E17.5天的胚胎心外膜上明顯表達(dá)。作為胚胎期生長因子，IGF2在胚胎心外膜的表達(dá)比IGF1更加明顯且高表達(dá)貫穿E11.5-E17.5天。
　　結(jié)論：IGF1R及其配體IGF1和IGF2在E11.5-E17.5天的胚胎心外膜上均有表達(dá)，提示IGF1R信號通路可能參與調(diào)控小鼠心外膜祖細(xì)胞的發(fā)育過程。
　　第二部分、IGF1R信號通路在心外膜祖細(xì)胞增殖中的作用及機制研究
　　目的：建立

6、小鼠心外膜祖細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，并通過干預(yù)細(xì)胞IGF1R信號通路，研究IGF1R信號通路是否參與調(diào)控心外膜祖細(xì)胞的增殖，并深入探討其調(diào)控增殖作用是否通過FAK介導(dǎo)實現(xiàn)。
　　方法：雌性及雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行交配，取E12.5d的胚胎心臟組織進(jìn)行心外膜祖細(xì)胞培養(yǎng)，使用免疫熒光染色技術(shù)檢測其特異性標(biāo)志物Tbx18和Wt1的表達(dá)情況來進(jìn)行細(xì)胞鑒定。同時也通過免疫熒光染色檢測IGF1R在體外培養(yǎng)的原代小鼠心外膜祖細(xì)胞中的表達(dá)情況。然后

7、分別用不同濃度的Picropodophyllin（PPP）（0、0.2μM、0.4μM、0.8μm和1.6μM）干預(yù)原代心外膜祖細(xì)胞72小時，CCK-8（Cell Counting Kit-8）檢測細(xì)胞增殖情況。然后將體外培養(yǎng)的原代心外膜祖細(xì)胞隨機分為兩組：對照組和PPP組（給予0.4μM PPP干預(yù)）。培養(yǎng)72小時后，使用免疫熒光染色檢測兩組細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)以及FAK（pY397）磷酸化水平；qRT-PCR測定Ki67、C

8、CND1（細(xì)胞周期蛋白CyclinD1編碼基因）以及Ptk2和Ptk2b（FAK編碼基因）在mRNA水平的表達(dá)情況，并通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組細(xì)胞之間細(xì)胞周期的變化。考慮到血清之中含有胰島素樣生長因子，將原代心外膜祖細(xì)胞培養(yǎng)基中的胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）由10%降至1%。然后，分別用不同濃度的IGF1（0、5ng/ml、10ng/ml和50ng/ml）和IGF2（0、10ng/ml、50ng/ml和100

9、ng/ml）干預(yù)細(xì)胞72h，CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況。并將細(xì)胞隨機分為：對照組、IGF1組（50ng/ml）、IGF2組（100ng/ml）、IGF1+Y15組（50ng/ml IGF1+1nM Y15）和 IGF2+Y15組（100ng/ml IGF2+1nM Y15）。CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖能力，免疫熒光染色檢測Ki67表達(dá)以及FAK（pY397）磷酸化情況，qRT-PCR檢測Ki67、CCND1、Ptk2和Ptk2在mRNA

10、水平的表達(dá)情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果：培養(yǎng)出來的細(xì)胞在倒置細(xì)胞顯微鏡下呈現(xiàn)“鋪路石”樣外觀，形態(tài)規(guī)則、單一，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核內(nèi)特異性表達(dá)Tbx18及Wt1，且陽性細(xì)胞數(shù)高。細(xì)胞免疫熒光染色提示小鼠心外膜祖細(xì)胞膜上點狀分布IGF1R。CCK-8實驗結(jié)果提示隨著PPP濃度的增加，心外膜祖細(xì)胞增值能力逐漸降低。與對照組相比，免疫熒光染色顯示PPP組細(xì)胞Ki67表達(dá)、FAK（pY397）磷酸化水平明顯下降，q

11、RT-PCR提示干預(yù)組細(xì)胞Ki67、CCND1、Ptk2以及Ptk2b mRNA表達(dá)明顯降低，流式細(xì)胞周期檢查結(jié)果提示PPP組細(xì)胞中處于G1期的細(xì)胞明顯增加，S和G2期細(xì)胞則明顯減少。不同濃度的IGF1和IGF2干預(yù)細(xì)胞72后，隨著生長因子濃度的增加，心外膜祖細(xì)胞的增殖能力逐漸升高。與對照組相比，IGF1與IGF2組細(xì)胞Ki67表達(dá)以及FAK(pY397)磷酸化水平明顯增高，Ki67、CCND1、Ptk2和Ptk2b mRNA的表達(dá)也明

12、顯升高，G1期細(xì)胞減少，S、G2期細(xì)胞增多；使用Y15特異性阻斷FAK（pY397）磷酸化后，Ptk2和Ptk2b在mRNA水平的表達(dá)不受影響，但引起Ki67、CCND1在mRNA水平的表達(dá)明顯降低，CCK-8顯示細(xì)胞增殖能力明顯受限，流式細(xì)胞周期檢查則提示細(xì)胞由G1期向S/G2期的轉(zhuǎn)化被明顯抑制。
　　結(jié)論：我們成功建立了心外膜祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，并證實IGF1R信號通路可參與調(diào)控心外膜祖細(xì)胞的增殖，且此作用可通過FAK介導(dǎo)實

13、現(xiàn)。
　　第三部分、IGF1R信號通路在心外膜祖細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究
　　目的：探索IGF1R信號通路是否能夠影響心外膜祖細(xì)胞EMT過程。
　　方法：同上，將體外培養(yǎng)的心外膜祖細(xì)胞隨機分為兩組：對照組和PPP組（給予0.4μM PPP干預(yù)）。培養(yǎng)72小時后，使用免疫熒光染色檢測細(xì)胞上皮標(biāo)志物ZO-1以及間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)情況；qRT-PCR測定Cdh1（上皮標(biāo)志物E-cadherin編碼基因）、T

14、jp1（ZO-1編碼基因）、Cdh2（間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin編碼基因）以及Vim（Vimentin編碼基因）在mRNA水平的表達(dá)情況。將心外膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)背景降低為1%FBS后，細(xì)胞隨機分為：對照組、IGF1組（50ng/ml）和IGF2組（100ng/ml）。免疫熒光染色檢測各組細(xì)胞ZO-1和Vimentin的表達(dá)情況，qRT-PCR檢測各組細(xì)胞Cdh1、Tjp1、Cdh2和Vim在mRNA水平的表達(dá)情況，以及Transwel

15、l實驗觀察三組細(xì)胞間遷移能力的差異。
　　結(jié)果：細(xì)胞免疫熒光染色及qRT-PCR的結(jié)果提示，對照組與PPP組細(xì)胞不論是ZO-1和Vimentin的表達(dá)還是Cdh1、Tjp1、Cdh2和Vim在mRNA水平的表達(dá)均無明顯差異。同樣地，IGF1與IGF2干預(yù)處理細(xì)胞也不能引起所檢測的EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的明顯改變。Transwell試驗提示IGF1及IGF2并不影響細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)論：IGF1R信號通路不影響心外膜祖細(xì)胞