CAR-T治療CEA陽性結(jié)直腸癌的臨床和基礎(chǔ)研究.pdf

1、嵌合性抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)T淋巴細(xì)胞(CAR-T)是通過將外源性人工設(shè)計(jì)的CAR基因?qū)隩淋巴細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因修飾改造，而后得到的表達(dá)CAR的特異性T細(xì)胞。CAR主要由可特異性識別腫瘤抗原的膜外片段，連接片段，和含刺激信號的膜內(nèi)片段組成。膜外片段主要是由靶向抗原分子的單鏈抗體(Single-chain variable fragment，scFv)組成，膜內(nèi)效應(yīng)分子則是由共刺激分子和CD3

2、ζ等T細(xì)胞活化基團(tuán)組成。主要的共刺激分子有CD28，CD27和CD137(4-1BB)等。細(xì)胞外scFv與抗原結(jié)合后可以啟動胞內(nèi)段信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并活化T淋巴細(xì)胞，最終活化的T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷。CAR-T細(xì)胞療法是通過對來源于患者自身的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因修飾而后將自體性CAR-T細(xì)胞回輸給病人治療腫瘤的方法，這是一種最前沿進(jìn)展的腫瘤免疫治療方法。
　　前期的臨床研究已經(jīng)顯示，特異性靶向CD19分子的CAR-T細(xì)胞能有效地治療B細(xì)

3、胞性惡性腫瘤（表達(dá)有CD19分子），包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，和B細(xì)胞淋巴瘤。目前的數(shù)據(jù)表明其對晚期復(fù)發(fā)難治性ALL的治療有效率可達(dá)到80％以上，對CLL和部分B細(xì)胞淋巴瘤的有效率＞50％，相關(guān)成果已多次在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志等頂級期刊發(fā)表。CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)成為血液系統(tǒng)腫瘤治療的一個突破性進(jìn)展。前期CAR-T在實(shí)體瘤的應(yīng)用較少，且療效并無其在血液腫瘤明顯，病人腫瘤緩解率低。去年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志再次

4、報(bào)道了該療法在實(shí)體瘤的重大突破，廣泛顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人在CAR-T細(xì)胞多次回輸后達(dá)到了完全緩解(Complete remission，CR)，該結(jié)果極大肯定和明確了CAR-T療法在實(shí)體瘤的應(yīng)用價值。所以，開展CAR-T療法在實(shí)體瘤的應(yīng)用是十分必要的。
　　癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA）是經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物，特別在結(jié)直腸癌病人中有80％以上陽性表達(dá)。正常組織細(xì)胞中只有消化道細(xì)胞有少量的C

5、EA在細(xì)胞膜表達(dá)，而該CEA在生理?xiàng)l件下朝向胞腔內(nèi)表達(dá)從而避免被靶向CEA的CAR-T細(xì)胞識別。所以CEA是CAR-T治療結(jié)直腸癌理想的靶點(diǎn)。針對CEA設(shè)計(jì)的CAR-T在國外已經(jīng)完成了動物實(shí)驗(yàn)以及Ⅰ期臨床試驗(yàn)，現(xiàn)有的CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床結(jié)果都是在國外獲得，且目前大多處于臨床Ⅰ期階段，病例總數(shù)尚不多;而且在不同的治療機(jī)構(gòu)以及病人個體間，治療的輸注細(xì)胞數(shù)量都不等，其標(biāo)準(zhǔn)在不同的個體之間尚需進(jìn)一步探索;更重要的是，我國的腫瘤在發(fā)病率

6、，腫瘤類型，和死亡率等方面都和西方國家不盡相同，目前我們國內(nèi)還沒有開展CAR-T療法在實(shí)體腫瘤應(yīng)用。因此，在我們國家開展CAR-T對腫瘤的臨床治療研究是非常必要的。
　　我們開展了CAR-T靶向CEA的臨床研究，而在臨床實(shí)踐中也因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞的不足而通過基礎(chǔ)研究來探究功能更強(qiáng)的CAR-T細(xì)胞。所以，我們的工作主要由臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究兩部分組成:
　　第一部分、CAR-T治療CEA陽性結(jié)直腸癌的臨床研究證實(shí)了其治療CE

7、A陽性結(jié)直腸癌的安全性和有效性:
　　為了開展靶向CEA的Ⅰ期CAR-T臨床試驗(yàn)，我們前期完成了靶向CEA的CAR-T細(xì)胞的制備，也在體外和動物體內(nèi)驗(yàn)證了其有效性和安全性。我們在國際臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)(clinicaltrial.gov)完成了注冊（編號:NCT02349724），同時也通過了第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。CEA在結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤中都有廣泛的表達(dá)，尤其在結(jié)直腸癌病人中CEA陽性率超過80％。在前期

8、的試驗(yàn)過程中，我們將重心聚焦在結(jié)直腸癌病人的收治上。我們?nèi)虢M了符合納排標(biāo)準(zhǔn)的10例難治復(fù)發(fā)性CEA陽性的結(jié)直腸癌病人，這10例病人全部伴有腸外器官轉(zhuǎn)移（部分病人原發(fā)灶已切除），其中絕大部分為肝轉(zhuǎn)移（7例）。通過采集病人外周血并在GMP實(shí)驗(yàn)室獲得T淋巴細(xì)胞，通過包含CAR序列的慢病毒(lentivirus)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞獲得CAR-T細(xì)胞。在細(xì)胞回輸前，我們使用了淋巴清除(lymphodepletion)的化療方案（氟達(dá)拉濱+環(huán)磷酰胺，F(xiàn)C）

9、對患者外周血的淋巴細(xì)胞進(jìn)行清除，為CAR-T細(xì)胞的注入提供良好環(huán)境，提高CAR-T治療的療效。大劑量CAR-T細(xì)胞的回輸治療實(shí)體瘤可能存在致死風(fēng)險，為了確保治療的安全性，我們采用了爬坡階梯的輸注模式，在確認(rèn)低劑量細(xì)胞回輸?shù)陌踩院?，再對后續(xù)病人使用高劑量細(xì)胞回輸。
　　通過試驗(yàn)，我們驗(yàn)證了CAR-T治療CEA陽性結(jié)直腸癌的安全性。在10例病人中，治療劑量從107至1010逐步增加，最高細(xì)胞回輸劑量達(dá)到了5x1010，所有病人均無嚴(yán)

10、重不良反應(yīng)發(fā)生（除FC化療對三系的影響），大部分病人僅報(bào)告少量1-2級不良事件。7例在前期化療療效評價為疾病進(jìn)展(Progressive disease，PD)的病人在接受CAR-T治療后腫瘤病灶大小保持穩(wěn)定，評價為病情穩(wěn)定(Stable disease，SD)，部分病人維持SD的時間超過了30周。雖然沒有達(dá)到部分緩解(Partial remission，PR)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但有兩例接受高劑量細(xì)胞回輸?shù)牟∪嗽谟跋駥W(xué)可見腫瘤有縮小。另外，大

11、部分病人的血清CEA在治療后明顯下降，提示了CAR-T細(xì)胞對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的抑制及殺傷作用。CAR-T細(xì)胞在外周血和體內(nèi)的存續(xù)以及其在體內(nèi)的增殖一直是CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的一個短板。在我們的臨床試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)接受高劑量細(xì)胞回輸?shù)牟∪薈AR-T細(xì)胞可以在體內(nèi)存活一定時間，甚至發(fā)現(xiàn)了CAR-T細(xì)胞在外周血的少量擴(kuò)增?？偠灾?，我們課題組在國內(nèi)首個報(bào)道了CAR-T在實(shí)體腫瘤應(yīng)用。通過入組10例符合倫理納排標(biāo)準(zhǔn)的晚期結(jié)直腸癌病人，結(jié)

12、合爬坡劑量的回輸模式，我們確認(rèn)了靶向CEA的CAR-T細(xì)胞在治療復(fù)發(fā)難治性結(jié)直腸癌的安全性。考慮到入組的病人均為臨床一線二線化療無效的難治性腫瘤，通過CAR-T治療后，大部分病人（7例/10例）的腫瘤得到了控制，一些病人的腫瘤病灶甚至在影像學(xué)上可以看到縮小。另外，CAR-T細(xì)胞的存活與擴(kuò)增也在我們的試驗(yàn)得到了驗(yàn)證。本臨床試驗(yàn)證明了CAR-T治療實(shí)體瘤的安全性以及其功能，為后續(xù)CAR-T的細(xì)胞優(yōu)化及臨床應(yīng)用提供了良好依據(jù)。
　　第二

13、部分、CAR-T治療CEA陽性結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究通過篩選和對比，我們找到了CAR-T最適、功能最佳的單鏈抗體scFv
　　在靶向CEA陽性腫瘤的CAR-T臨床試驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)了目前CAR-T細(xì)胞所需要優(yōu)化和改良的地方。CAR-T可以控制和抑制實(shí)體腫瘤的生長，但未能完成對腫瘤的清除，這提示我們需要功能更強(qiáng)的CAR-T細(xì)胞。目前CAR-T細(xì)胞聯(lián)用PD-1，趨化因子受體(Cxc chemokine receptor，CXCR)均已被證實(shí)

14、可以提高CAR-T細(xì)胞療效。CAR自身結(jié)構(gòu)中的scFv和共刺激信號也會對CAR-T細(xì)胞的功能造成不同的影響，不同scFv與共刺激信號會產(chǎn)生不同功能的CAR。前期報(bào)道提示低親和力的scFv相比于高親和力的scFv（兩個scFv為源于同一個單抗的不同突變體）甚至表現(xiàn)出對CEA陽性腫瘤更好的殺傷以及對CEA陰性或弱陽性細(xì)胞更好的安全性。而在不同雜交瘤來源的scFv（靶向不同表位）之間對比發(fā)現(xiàn)，高親和力利于提高CAR-T的功能。所以，scFv的

15、親和力與CAR-T細(xì)胞功能是否呈正相關(guān)尚無定論。另外，在培養(yǎng)病人的CAR-T細(xì)胞過程中，我們也發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞表面的CAR表達(dá)陽性率CAR+％在培養(yǎng)過程中呈逐漸下降的趨勢，部分病人的CAR+％在細(xì)胞回輸前降至20％以下，個別病人甚至因?yàn)榈陀?0％的CAR+％而取消細(xì)胞回輸。我們檢測了靶向HER2和CD19的CAR-T細(xì)胞(僅僅替換了CEA CAR結(jié)構(gòu)的scFv)的CAR變化，上述兩種CAR-T細(xì)胞的CAR+％在培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定。因此

16、，我們推測CEA CAR-T的CAR+％下降的原因可能與scFv有關(guān)。因此，為探究scFv與CAR+％下降的問題并篩選功能最佳的scFv，我們篩選了幾種已知的CEA單抗。我們用于CEA CAR-T的scFv序列是從靶向CEA的單克隆抗體(Monoclonal antibody，mAb) BW431/26中獲得，同時我們也找到了其他在目前廣泛應(yīng)用的CEA單克隆抗體M5A，hMN-14和C2-45。我們找到上述四種單抗的序列并構(gòu)建出相應(yīng)的s

17、cFv，通過真核細(xì)胞表達(dá)和蛋白純化得到4種scFv蛋白，我們檢測了4種scFv的親和力，發(fā)現(xiàn)M5A和hMN-14的親和力最高，而BW431/26的親和力最低。同時，我們把各scFv的序列裝載到相同的3代CAR骨架并構(gòu)建出對應(yīng)的病毒且完成了對T細(xì)胞的感染，獲得了相應(yīng)的CAR-T。通過比較4個CAR的CAR+％，我們發(fā)現(xiàn)M5A和hMN-14的CAR-T細(xì)胞的CAR+％在培養(yǎng)過程中可以穩(wěn)定表達(dá)，而BW431/26的CAR+％仍呈下降趨勢，C2

18、-45的CAR+％則持續(xù)檢測不到。為了驗(yàn)證CAR-T表面的CAR功能，我們用重組CEA蛋白刺激各CAR-T后檢測凋亡和表面凋亡分子(Tim-3)發(fā)現(xiàn)M5A，hMN-14和BW431/26 CAR-T的相應(yīng)指標(biāo)有明顯升高，提示上述CAR-T對CEA刺激的反應(yīng)，這也證明了上述CAR-T細(xì)胞表面的CAR是有功能的。另外，我們也通過細(xì)胞殺傷試驗(yàn)比較了各CAR-T細(xì)胞的功能，發(fā)現(xiàn)M5ACAR-T對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的體外殺傷效果優(yōu)于hMN-14和