F9細胞中CHIR99021下調Dnmt31基因的機制研究.pdf

1、表觀遺傳是在不改變DNA的序列的情況下對DNA或染色體的修飾。DNA甲基化是主要的表觀遺傳修飾，具有重要的調控功能。DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)能夠催化甲基從S腺苷甲硫氨酸轉移到DNA。哺乳動物中的DNMT家族有五個成員:DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B，DNMT3L，其中DNMT3L因缺少催化結構域而不具有任何催化活性，但會與DNMT3A和DNMT3B相互作用促進它們的活

2、性。
　　Wnt信號通路是胚胎發(fā)育過程中重要的組成，其中經典Wnt通路依賴β-catenin轉運到細胞核中，通過與T細胞因子/淋巴增強結合因子(T-cell factor/lymphoidenhancer-binding factor， TCF/LEF)結合，激活或抑制下游基因的表達。CHIR99021與PD0325901能夠起到抑制細胞分化的作用，其中CHIR99021是常用的GSK3β的抑制劑，通過抑制此酶活性，使β-cate

3、enin在核內積累，達到Wnt后續(xù)的轉錄信號傳遞。
　　本文首先利用實時定量PCR實驗，確定了不同濃度CHIR99021對甲基轉移酶家族基因的表達影響，發(fā)現(xiàn)對Dnmt31基因有明顯下調作用，而對于Dnmt3a，Dnmt3b等其余家族基因沒有明顯作用。利用蛋白免疫印跡實驗確定了針對小鼠F9細胞，最適的CHIR99021處理濃度為10μM，并以此為重點進行后續(xù)研究，確定CHIR99021下調基因的具體機制。
　　通過構建pCMV

4、-Myc-β-catenin、pCDNA3.1-β-catenin和pCDNA3.1-β-catenin S37A載體，利用核質蛋白分離提取實驗以及蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，CHIR99021對F9細胞處理后，β-catenin蛋白的總表達量有明顯提高，并且細胞質和細胞核內的β-catenin含量都比對照組高，說明，CHIR99021可以通過抑制GSK3β來增加細胞質中β-catenin的穩(wěn)定性，并且入核量也隨之增高。通過雙熒光素酶報告實驗

5、證明CHIR99021會對Wnt/β-catenin經典通路造成影響，激活該通路。過表達β-catenin后，Dnmt31基因的表達出現(xiàn)下調，因此可得，在小鼠F9細胞中CHIR99021能夠通過抑制GSK3β，使β-catenin在細胞核中積累，激活Wnt/β-catenin經典通路，最終導致Dnmt31基因的抑制。
　　β-catenin進入細胞核后，通常會與TCF/LEF復合體共同作用，并激活基因的轉錄，而對于本文研究基因Dn

6、mt31的抑制效果很少見。此復合體中起到抑制效果的只有TCF3蛋白，其余成員起轉錄激活效果，而近期研究對TCF3的抑制機制并不明確，而且對其在經典Wnt通路的作用沒有準確和唯一的答案，因此，我對TCF3在此機制中的作用進行了研究。本實驗利用RNA干擾，免疫熒光染色，實時定量PCR和蛋白免疫印跡實驗，確定下調Tcf3(Tcf7l1)基因的表達會對Dnmt31基因有上調的影響，并且Tcf3和β-catenin基因在經過CHIR99021處理