基于VEGF-VEGFR2-SRC信號(hào)通路探討補(bǔ)青顆粒對(duì)大鼠晶狀體氧化應(yīng)激的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：
　　探討補(bǔ)青顆粒對(duì)紫外線(xiàn)照射所致的大鼠晶狀體氧化應(yīng)激平衡狀態(tài)、對(duì)VEGF-VEGFR2-SRC信號(hào)通路表達(dá)的影響，為補(bǔ)青顆粒用于臨床治療年齡相關(guān)性白內(nèi)障（ARC）提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　?。?）SPF級(jí)雄性SD大鼠，經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查排除雙眼晶狀體疾病及其他眼部疾病。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為六組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、杞菊地黃丸組、補(bǔ)青顆粒高、中、低劑量組，除空白對(duì)照組外，其余各組分別采用中波紫外線(xiàn)照

2、射復(fù)制SD大鼠晶狀體氧化應(yīng)激模型，造模期間同時(shí)給予相應(yīng)水溶液灌胃。陽(yáng)性對(duì)照組選用杞菊地黃丸1g/ml水溶液灌胃；補(bǔ)青顆粒高、中、低劑量組分別給予4g/ml、2g/ml、1g/ml的水溶液灌胃；模型組、空白組均用生理鹽水（10ml/kg）代替藥物灌胃。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)大鼠精神狀況、視物情況、二便等一般情況進(jìn)行每日觀(guān)察及記錄；對(duì)紫外線(xiàn)照射期間晶狀體的混濁程度進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀(guān)察。造模成功指標(biāo)：裂隙燈下觀(guān)察大鼠晶狀體周邊皮質(zhì)，可見(jiàn)空泡。
　?。?）灌

3、胃結(jié)束后，選用HE染色法觀(guān)察晶狀體上皮細(xì)胞病理學(xué)組織情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)血清中SOD、GSH-PX活性變化以及MDA含量改變。取空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)青顆粒高劑量組各組晶狀體，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)（Real Time-PCR法）檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞中VEGF、VEGF-R2以及SRC在RNA水平的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞中VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC的表達(dá)情況；免疫蛋白印跡法（Weste

4、rn Blot法）測(cè)定晶狀體上皮細(xì)胞中VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）紫外線(xiàn)照射前期，各組大鼠無(wú)明顯盲目表現(xiàn)，行動(dòng)自如，生長(zhǎng)狀況良好，個(gè)別大鼠精神萎靡不振，偶見(jiàn)鼻衄等現(xiàn)象；后期各組大鼠均有精神不振、眼神迷離、嗜睡，明亮光線(xiàn)下，瞳孔縮小等白內(nèi)障表現(xiàn)。裂隙燈下見(jiàn)空白對(duì)照組晶狀體無(wú)混濁，始終保持透明；紫外線(xiàn)照射第5天，晶狀體混濁不明顯；照射第10天，晶狀體纖維結(jié)構(gòu)紊亂，水腫明顯

5、，大部分晶狀體皮質(zhì)區(qū)見(jiàn)密集中等空泡，屬于Ⅱ期白內(nèi)障；第15天晶狀體混濁程度加深，白內(nèi)障不斷發(fā)展。
　　（2）造模期間，裂隙燈觀(guān)察結(jié)果示：在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行開(kāi)始階段，模型組在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第三天時(shí)，Ⅰ期白內(nèi)障發(fā)病率為57%，與空白對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；隨著紫外線(xiàn)照射時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組SD大鼠處于Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期例數(shù)以及百分比逐漸增高，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。由結(jié)果可知，陽(yáng)性對(duì)照組與補(bǔ)青顆粒各治療組均可

6、以延緩白內(nèi)障發(fā)展，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）；補(bǔ)青顆粒高劑量組效果最明顯（P＜0.05）。
　?。?）HE染色示：空白對(duì)照組晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cells,LECs）為單層立方上皮細(xì)胞，鏡下觀(guān)察，細(xì)胞形態(tài)整齊規(guī)則，纖維排列緊密；模型組LECs形態(tài)不規(guī)則，染色深淺不一，晶狀體纖維結(jié)構(gòu)紊亂；陽(yáng)性對(duì)照杞菊地黃丸組晶狀體組織損傷減輕，LECs排列較規(guī)則，染色淡，晶狀體纖維排列較完整；補(bǔ)青顆粒組晶狀體組

7、織損傷減輕，LECs排列致密工整，晶狀體纖維排列較杞菊地黃丸組完整，尤以補(bǔ)青高劑量組最明顯。
　?。?）免疫組化結(jié)果示：模型組SD大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC的陽(yáng)性表達(dá)較空白對(duì)照組均明顯升高，差異具有顯著性（P<0.05）；藥物干預(yù)后，補(bǔ)青顆粒組、杞菊地黃丸組VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC陽(yáng)性表達(dá)明顯降低，差異具有顯著性（P<0.05）；各治療組之間相比結(jié)果顯示，補(bǔ)青顆粒高劑量

8、組VEGF、VEGF-R2、SRC以及P-SRC陽(yáng)性表達(dá)較杞菊地黃丸組減少，差異具有顯著性（P<0.05）。
　?。?）血清結(jié)果示：相比于空白對(duì)照組，模型組SOD、GSH-PX活性明顯降低，而MDA含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藥物干預(yù)后，補(bǔ)青顆粒各治療組與杞菊地黃丸組比較結(jié)果顯示，隨著補(bǔ)青顆粒濃度的逐漸增高，SD大鼠血清中SOD、GSH-PX活性增加越顯著，MDA含量降低越明顯，且兩者的變化具有計(jì)量依賴(lài)性，差

9、異顯著（P＜0.05）。
　?。?）Real Time-PCR結(jié)果顯示：模型組與空白對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠晶狀體組織中VEGF、VEGF-R2、SRC在RNA水平表達(dá)顯著升高，差異顯著性非常高（P＜0.01）；中藥干預(yù)后，補(bǔ)青顆粒組與模型組比較，VEGF、VEGF-R2、SRC在RNA水平表達(dá)有了顯著降低（P＜0.01）；而杞菊地黃丸組與模型組比較，VEGF mRNA、SRC mRNA表達(dá)差異不具有顯著性（P＞0.05）

10、；補(bǔ)青顆粒高劑量組與空白對(duì)照組比較，三種因子在RNA表達(dá)差異具有顯著性（P＜0.05）。
　?。?）Western Blot：紫外線(xiàn)照射之后，模型組與空白對(duì)照組相比，大鼠晶狀體中VEGF、VEGF-R2、SRC和R-SRC蛋白表達(dá)水平均有明顯升高，差異非常具有顯著性（P＜0.01）；而藥物干預(yù)后，各藥物治療組與模型對(duì)照組相比，VEGF、VEGF-R2和SRC蛋白表達(dá)水平，均有下降，差異具有顯著性（P＜0.01），而杞菊地黃丸治療組

11、R-SRC蛋白表達(dá)水平，與模型組比較，差異不具顯著性（P＞0.05）；補(bǔ)青顆粒高劑量組R-SRC蛋白表達(dá)水平，與空白對(duì)照組相比，差異顯著性不明顯（P＞0.05）；補(bǔ)青顆粒高劑量組與杞菊地黃丸組比較，具有明顯的差異性（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、氧化應(yīng)激可能是白內(nèi)障發(fā)生的主要作用機(jī)制之一；
　　2、補(bǔ)青顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)晶狀體中VEGF-VEGFR2-SRC等相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)紫外線(xiàn)照射所致大鼠晶狀體混濁的發(fā)生和