TNF-α促進(jìn)B7-H1介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的適應(yīng)性免疫抵抗.pdf

1、目的
　　肝癌(Hepatocellular carcinoma)是僅次于肺癌的世界第二大致死性癌癥，成為危害人類(lèi)健康的主要疾病之一。肝細(xì)胞肝癌是一種典型的炎癥相關(guān)性腫瘤，通常由慢性的肝炎患者發(fā)展而來(lái)，慢性炎癥的炎癥微環(huán)境與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。陳列平教授提出腫瘤免疫逃逸的“適應(yīng)性抵抗假說(shuō)”，假說(shuō)指出，腫瘤細(xì)胞針對(duì)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了一個(gè)適應(yīng)自身生存的微環(huán)境。腫瘤的產(chǎn)生是幾年甚至數(shù)十年的漫長(zhǎng)過(guò)程，或許腫瘤組織已經(jīng)將微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的免

2、疫反應(yīng)改造為適應(yīng)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。腫瘤組織浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子例如，IFN-γ，IFN-γ作用于免疫細(xì)胞可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)IFN-γ也可以使腫瘤細(xì)胞B7-H1分子表達(dá)增加，表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的B7-H1分子與T細(xì)胞表面的受體PD-1結(jié)合，PD-1是表達(dá)在T細(xì)胞表面的一種重要的免疫抑制性蛋白，B7-H1與PD-1結(jié)合可以抑制T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致T細(xì)胞功能的耗竭，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸

3、。
　　隨著免疫療法的不斷發(fā)展進(jìn)步，特別是近幾年免疫檢查點(diǎn)療法的迅速發(fā)展，人類(lèi)對(duì)于腫瘤的治療取得了很大進(jìn)步。最新一代的免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過(guò)阻斷淋巴細(xì)胞上PD1與抗原呈遞細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞上的B7-H1分子的相互作用而發(fā)揮治療效果。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)B7-H1藥物應(yīng)用于臨床治療非小細(xì)胞肺癌和膀胱癌，其余適應(yīng)癥正在臨床實(shí)驗(yàn)階段。
　　腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenviroment，TME)是腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的復(fù)雜環(huán)境，1主要由

4、多種細(xì)胞和蛋白質(zhì)組成，不僅起支架作用還含有大量的細(xì)胞因子。B7-H1的表達(dá)受多種細(xì)胞因子的影響，例如IFN-γ、 TNF-α、IL-4和VEGF等，在肝癌的腫瘤微環(huán)境中含有大量的細(xì)胞因子，IFN-γ和TNF-α是其中兩種最主要的細(xì)胞因子。那么，我們推測(cè)在腫瘤微環(huán)境中IFN-γ是否能引起肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)？TNF-α是否能引起肝癌細(xì)胞B7-H1分子的升高？二者在促進(jìn)B7-H1升高中有怎樣的聯(lián)系？以及表達(dá)增加的B7-H1分子是否具

5、有免疫抵抗功能？
　　針對(duì)上述問(wèn)題我們進(jìn)行了如下研究，本課題首先研究了IFN叫可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子，以及主要通過(guò)的信號(hào)通路是JAK/STAT1信號(hào)通路。并且發(fā)現(xiàn)TNF-α與IFN-γ可以協(xié)同促進(jìn)B7-H1分子的表達(dá)。進(jìn)一步研究協(xié)同促進(jìn)作用的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)IFN-γ信號(hào)通路的活化，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)增加。為了進(jìn)一步研究TNF-α

6、和IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能，我們進(jìn)行了T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明協(xié)同誘導(dǎo)的B7-H1分子能抑制T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。所以TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)的B7-H1分子具有免疫抵抗作用。
　　方法：
　　一、IFN-γγ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子
　?。ㄒ唬〣7-H1分子的表達(dá)對(duì)于IFN-γ有濃度和時(shí)間的依賴(lài)性
　　肝癌細(xì)胞SMMC-772

7、1種板貼壁后，采用不同濃度的IFN-γ誘導(dǎo)B7-H1的表達(dá)，將儲(chǔ)存液濃度為100 ng/μl的IFN-γ進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊渥饔脻舛确謩e為100 ng/ml、50 ng/nl、20 ng/ml、10 ng/ml，誘導(dǎo)細(xì)胞24h后收RNA，RT-PCR檢測(cè)B7-H1 RNA水平的表達(dá)情況。進(jìn)一步檢測(cè)在相同濃度的IFN-γ(50 ng/ml)誘導(dǎo)下，B7-H1表達(dá)隨時(shí)問(wèn)的變化，分別誘導(dǎo)0、1、2、3、6、12、24h采用RT-PCR以及qPCR的

8、方法檢測(cè)B7-H1分子的表達(dá)情況。
　?。ǘ㊣FN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子在RNA以及蛋白水平的表達(dá)
　　本實(shí)驗(yàn)所用的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7和Hep3B均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，這四種肝癌細(xì)胞均在50 ng/ml IFN-γ誘導(dǎo)6h的條件下采用RT-PCR方法檢測(cè)B7-H1RNA水平的表達(dá)。我們選擇其中兩種細(xì)胞系 SMMC-7721和HuH-7進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，在50 ng/ml I

9、FN-γ誘導(dǎo)6h的條件下用qPCR方法進(jìn)一步檢測(cè)B7-H1 RNA水平的表達(dá)。采用50ng/ml IFN-γ誘導(dǎo)24h后，用PBS清洗一次去除死亡細(xì)胞，再用胰酶將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，清洗去除胰酶，再標(biāo)記人B7-H1的流式抗體，同時(shí)采用同型抗體去除非特異性著色，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)B7-H1蛋白水平的表達(dá)。
　　二、 IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子表達(dá)主要通過(guò)的信號(hào)通路
　　首先檢測(cè)IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1

10、分子涉及的信號(hào)通路。將SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁后再加入IFN-γ(50ng/ml)，分別誘導(dǎo)0、5、15、30、60min，Western-blot方法檢測(cè)p-STAT1、p-AKT、p-P65、p-P38、p-MEK和p-JNK的活化情況。
　　根據(jù)檢測(cè)到的IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子涉及的信號(hào)通路購(gòu)買(mǎi)信號(hào)通路的抑制劑。Western-blot方法顯示涉及的信號(hào)通路有NF-κB、PI3K、MEK、JNK、P38

11、、JAK/STAT1。首先采用Western-blot方法檢測(cè)各種抑制劑(BAY11-7082(NF-κB)、LY294002(PI3 Kα/δ/β)、U0126(MEK1/2),、SP600125(JNK1/2/3)、SB202190(p38α/β)、Ruxolitinib(JAK1/2))對(duì)于對(duì)應(yīng)信號(hào)通路的抑制效果以及最適抑制濃度。將SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁后，提前采用最適濃度抑制劑處理1h，再加入IFN-γ(50ng/ml)

12、同時(shí)含有新抑制劑，37℃，培養(yǎng)15min，加入蛋白裂解液收細(xì)胞蛋白，采用Western-blot的方法檢測(cè)最適抑制劑濃度。
　　檢測(cè)IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子主要通過(guò)的信號(hào)通路。將SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁后，提前運(yùn)用最適濃度的抑制劑處理1h，再加入IFN-γ(50ng/ml)同時(shí)含有新抑制劑，37℃，誘導(dǎo)細(xì)胞6h用qPCR方法檢測(cè)B7-H1的表達(dá)情況。
　　進(jìn)一步采用小干擾確證IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1

13、分子表達(dá)主要通過(guò)JAK/STAT1信號(hào)通路。所以合成JAK/STAT1信號(hào)通路中兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF1的小干擾。首先驗(yàn)證小干擾的干擾效果，SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁，第二天大約生長(zhǎng)至70％進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h后收RNA，RT-PCR的方法檢測(cè)STAT1和IRF1的表達(dá)水平，選擇干擾效果好的進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SMMC-7721細(xì)胞種板轉(zhuǎn)染STAT1和IRF1小干擾，24h后加IFN-γ(50 ng/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞6h，qP

14、CR檢測(cè)B7-H1 RNA水平的變化。
　　三、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子
　　SMMC-7721或HuH-7細(xì)胞種板貼壁后，分別用TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ（5ng/ml）或者二者同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞，6h后收RNA，采用qPCR方法檢測(cè)在RNA水平B7-H1分子的表達(dá)變化情況。誘導(dǎo)24h后采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)蛋白水平的變化。
　　四、 TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表

15、達(dá)B7-H1分子的機(jī)制
　?。ㄒ唬┓治鯰NF-α對(duì)于IFN.-γ信號(hào)通路的作用
　　運(yùn)用各種信號(hào)通路的抑制劑檢測(cè)TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)B7-H1表達(dá)過(guò)程中信號(hào)通路的變化。先將SMMC-7721細(xì)胞或HuH-7細(xì)胞種板貼壁后用抑制劑處理，37℃，1h，抑制信號(hào)通路的活性，再用TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)同時(shí)含有抑制劑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞，6h后收細(xì)胞的RNA，運(yùn)用qPCR方法檢測(cè)B7-H1分子的

16、表達(dá)變化情況。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的變化，我們運(yùn)用信號(hào)通路的小干擾RNA，siSTAT1、siIRF1、siP65、sic-JUN、sic-FOS和siATF2，12孔板，轉(zhuǎn)染小干擾RNA24h后加TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞，6h后收RNA，運(yùn)用qPCR方法檢測(cè)B7-H1分子的變化情況。
　　將種板貼壁后的細(xì)胞用TNF-α（50ng/ml）和IFN-γ(5ng/ml)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)

17、胞表達(dá)B7-H1分子，24h后收細(xì)胞蛋白，用Western-blot方法檢測(cè)蛋白水平JAK/STAT1信號(hào)通路中JAK2以及p-JAK2、STAT1以及p-STAT1的變化情況。
　?。ǘ㏕NF-α對(duì)于IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的影響
　　檢測(cè)JAK/STAT1信號(hào)通路上游分子IFNGR1、IFNGR2的變化情況。將種板貼壁后的細(xì)胞分別用TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ(5ng/ml)或者二者同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B

18、7-H1分子，6h后收細(xì)胞的RNA，qPCR的方法檢測(cè)IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的變化。
　　為了進(jìn)一步研究TNF-α增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的機(jī)制。首先查閱文獻(xiàn)TNF-α主要的信號(hào)通路有NF-κB、MEK、P38、JNK等，運(yùn)用這些信號(hào)通路的抑制劑抑制細(xì)胞，將SMMC-7721細(xì)胞或HuH-7細(xì)胞種板貼壁后提前1h加抑制劑處理(5μM BAY11-7082(NF-κB)、5μM U0126(MEK1/2)、5μM

19、SB202190(p38α/β)、5μM SP600125(JNK1/2/3))，再運(yùn)用TNF-α(50ng/ml)誘導(dǎo)6h，qPCR的方法檢測(cè)IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的變化。
　　為了進(jìn)一步確證TNF-α是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)，運(yùn)用小干擾試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。將SMMC-7721細(xì)胞或HuH-7細(xì)胞種板貼壁后轉(zhuǎn)染siP65，24h后再用TNF-α(50ng/ml)誘導(dǎo)6h，qPCR的方法檢測(cè)I

20、FNGR1、IFNGR2表達(dá)的變化。
　　五、TNF噸與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子具有免疫抵抗功能
　　為了驗(yàn)證TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能，我們進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　?。ㄒ唬┬∈竽[瘤細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
　　1.TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子
　　小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6貼

21、壁后，采用IFN-γ、TNF-α或者IFN-γ和TNF-α同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子，誘導(dǎo)6h后，收細(xì)胞RNA，qPCR方法檢測(cè)Hepa1-6細(xì)胞表面B7-H1分子RNA水平表達(dá)的變化情況。
　　細(xì)胞因子誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞24h，用PBS清洗一次去除死亡細(xì)胞，再用胰酶將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，清洗去除胰酶，標(biāo)記小鼠B7-H1流式抗體，檢測(cè)B7-H1蛋白水平的變化。
　　2.腫瘤細(xì)胞種板和轉(zhuǎn)染
　　合成小鼠B7-H1

22、的小干擾，首先檢測(cè)小干擾的效果。Hepa1-6細(xì)胞種板，12孔板，每孔1.8×105個(gè)細(xì)胞，第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至70％進(jìn)行轉(zhuǎn)染小鼠B7-H1小干擾。轉(zhuǎn)染24h，qPCR檢測(cè)RNA水平的變化。轉(zhuǎn)染48h，Western-blot檢測(cè)蛋白水平的變化。
　　第一天下午小鼠Hepa1-6種板，12孔板每孔1.8×105個(gè)。第二天上午生長(zhǎng)至70％左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染小鼠B7-H1。
　　3.腫瘤細(xì)胞用IFN-γ和TNF-α處理
　　IFN-

23、γ儲(chǔ)存濃度為50ng/μl，作用濃度為5ng/ml，取2μl儲(chǔ)存液溶于18μl的T細(xì)胞培養(yǎng)基中，稀釋后濃度為5ng/μl，則每1ml培養(yǎng)基中加1μl IFN-γ稀釋液。TNF-α儲(chǔ)存濃度為100ng/μl，作用濃度為50ng/ml，取8μl儲(chǔ)存液溶于72μl的T細(xì)胞培養(yǎng)基中，稀釋后濃度為10ng/μl，則每1ml培養(yǎng)基中加5μl TNF-α稀釋液。上述Hepa1-6細(xì)胞種板轉(zhuǎn)，6h換液同時(shí)加IFN-γ和TNF-α處理。
　　4.將

24、腫瘤細(xì)胞用mitomycinC處理
　　第三天上午，將腫瘤細(xì)胞用mitomycinC處理，mitomycinC粉末5mg，加747.65μl DMSO稀釋后濃度為20mM，即6.687μg/μl。設(shè)置濃度梯度確定最適宜mitomycinC處理的作用濃度，將最適濃度的mitomycinC加入上述轉(zhuǎn)染且已用IFN-γ和TNF-α處理的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)板中，靜置37℃，30min，清洗三次去除殘留的mitomycinC。
　　5.取小

25、鼠單個(gè)核細(xì)胞
　　第三天上午取SPF級(jí)的6-8W周C57BL/6J小鼠，脫頸處死置于75％酒精中浸泡5min，超凈工作臺(tái)中取小鼠脾臟組織，取出后在PBS中清洗2遍。置于70μM的過(guò)濾器上先用剪刀剪碎再用5ml針?biāo)ㄑ心?，?xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，離心1000rpm，5min，用3ml Tris-NH4Cl重懸沉淀裂解紅細(xì)胞，靜置3min。加5ml培養(yǎng)基阻止裂紅，1000rpm，5min。用2ml T細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，取1ml溶于

26、9ml中進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?jì)數(shù)。
　　6.CFSE染色
　　CFSE每管粉末50μg，分子量為557.47，每管加18ul DMSO，則懸液的濃度為5mM。設(shè)置濃度梯度選擇較好的CFSE作用濃度。12孔板每孔需單個(gè)核細(xì)胞1.6×106個(gè)，按所需的細(xì)胞數(shù)計(jì)算所需T細(xì)胞懸液的量，離心，1000r/min，5min。用最適濃度的CFSE溶液重懸細(xì)胞，室溫靜置7min，加5倍體積含有血清的培養(yǎng)基冰上靜置5min。用大量含血清培養(yǎng)基清洗

27、三次，最后用T細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。
　　設(shè)置濃度梯度選擇適宜的ConA作用濃度，根據(jù)每孔需要T細(xì)胞、IFN-γ、TNF-α以及ConA配成細(xì)胞懸液，加入到用mitomycinC處理的腫瘤細(xì)胞孔中進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)第二天，每孔各加1ml T細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中是否需要IFN-γ、TNF-α以及ConA都與前述孔中液體相同。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
　　共培養(yǎng)72h，采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況。將12孔板中

28、的細(xì)胞懸液加入到對(duì)應(yīng)流式管中，用PBS清洗一次將清洗的PBS也加入到對(duì)應(yīng)管中。用胰酶消化殘留細(xì)胞，將細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的流式管中，1000r/min，5min。用50μl含0.5％血清的PBS重懸。標(biāo)記CD3抗體4℃，45min。每管加3ml含0.5％血清的PBS清洗一次，1000r/min，5min。用300μl含0.5％血清的PBS重懸，用400目銅網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B7-H1分子在蛋白水平表達(dá)的情況。
　?。ǘ﹦?dòng)物

29、實(shí)驗(yàn)
　　1.小鼠肝癌細(xì)胞系的準(zhǔn)備選擇狀態(tài)較好的小鼠肝癌細(xì)胞hepa1-6，將hepa1-6細(xì)胞大量擴(kuò)增。
　　2.皮下成瘤
　　將瓶中的細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整濃度大約4×106個(gè)/ml，選擇SPF級(jí)的6-8W周C57BL/6J小鼠，每只小鼠腹部皮下注射100μl細(xì)胞懸液，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。
　　根據(jù)腫瘤大小將小鼠平均分為3組，A組注射siNC，B組注射siNC、IFN-γ和TNF-α，C組注射siB7

30、-H1、1FN-γ和TNF-α。
　　3.注射小于擾RNA和細(xì)胞因子
　　第一天將粉末小干擾RNA用DEPC水溶解，每只小鼠大約10μg siRNA。運(yùn)用專(zhuān)用體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑polyplus in vivo-jetPEI進(jìn)行瘤內(nèi)注射。
　　第二天瘤內(nèi)注射細(xì)胞因子TNF-α0.5μg/只，IFN-γ0.05μg/只，小干擾和細(xì)胞因子每三天注射一次，小干擾和細(xì)胞因子共注射四次。
　　4.腫瘤體積的測(cè)量
　　第三天測(cè)

31、量腫瘤體積，整個(gè)過(guò)程腫瘤體積測(cè)量六次。
　　結(jié)果：
　　一、 IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子
　　為了檢測(cè)IFN-γ是否能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系B7-H1分子的表達(dá)，運(yùn)用肝癌細(xì)胞系SMMC-7721在不同濃度IFN-γ誘導(dǎo)條件下檢測(cè)B7-H1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在采用不同濃度IFN-γ吖誘導(dǎo)條件下所表達(dá)的B7-H1分子的強(qiáng)度不同，隨著IFN-γ濃度增加B7-H1分子的表達(dá)量增加，但是IFN-γ到達(dá)一定濃度時(shí)B7-H1

32、分子的表達(dá)強(qiáng)度不再增加，同時(shí)結(jié)果顯示50ng/ml的IFN-γ是引起B(yǎng)7-H1表達(dá)的最適濃度。相同濃度的IFN-γ(50ng/ml)誘導(dǎo)不同時(shí)間所表達(dá)的B7-H1分子的強(qiáng)度也不同，在0-6h隨著時(shí)間延長(zhǎng)B7-H1分子的表達(dá)量增強(qiáng)，6h之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)B7-H1分子的表達(dá)降低。為了進(jìn)一步確認(rèn)上述現(xiàn)象，我們又在另外幾種肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7、Hep3B中進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示IFN-γ均可以誘導(dǎo)上述幾種肝

33、癌細(xì)胞B7-H1分子在RNA水平的表達(dá)。又進(jìn)一步運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)IFN-γ是否可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子在蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示在SMMC-7721和HuH-7細(xì)胞中，IFN-γ均可以誘導(dǎo)B7-H1分子在蛋白水平的表達(dá)
　　二、 IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1的表達(dá)主要通過(guò)JAK/STAT1信號(hào)通路。
　　用Western-blot方法檢測(cè)到IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子涉及多種信號(hào)通路。進(jìn)一步用W

34、estern-blot方法檢測(cè)各種抑制劑的最適抑制濃度，在IFN-γ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上運(yùn)用最適濃度的抑制劑，結(jié)果顯示多條信號(hào)通路對(duì)于IFN-γ誘導(dǎo)的B7-H1的表達(dá)都有影響，但起主要作用的是JAK/STAT1信號(hào)通路。
　　轉(zhuǎn)染JAK/STAT1信號(hào)通路中主要的轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF1的小干擾后，再用IFN-γ誘導(dǎo)，結(jié)果顯示B7-H1的表達(dá)明顯降低，驗(yàn)證了上述結(jié)論JAK/STAT1信號(hào)通路在這個(gè)過(guò)程中起主要作用。
　　三、 T

35、NF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)
　　在SMMC-7721細(xì)胞和HuH-7細(xì)胞中采用TNF-α、IFN-γ或者二者同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子，研究發(fā)現(xiàn)，二者同時(shí)誘導(dǎo)比單用TNF-α或者IFN-γ時(shí)B7-H1分子在RNA水平以及蛋白水平的表達(dá)都有明顯升高。所以，TNF-α和IFN-γ在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1表達(dá)過(guò)程中二者具有明顯的協(xié)同促進(jìn)作用。
　　四、 TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B

36、7-H1分子的機(jī)制
　　為了研究二者協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子過(guò)程中主要的信號(hào)通路，運(yùn)用抑制劑抑制信號(hào)通路的活化，同時(shí)運(yùn)用TNF-α、IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子。結(jié)果顯示，在二者協(xié)調(diào)誘導(dǎo)B7-H1分子表達(dá)過(guò)程中起主要作用的信號(hào)通路還是JAK/STAT1信號(hào)通路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證JAK/STAT1信號(hào)通路的作用，運(yùn)用信號(hào)通路的小干擾RNA，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用siSTAT1、siIRF1的小干擾后B7-H1下降較明顯與抑制劑的效

37、果一致。
　　進(jìn)一步檢測(cè)JAK/STAT1信號(hào)通路蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)在蛋白水平JAK2、STAT1磷酸化水平增加，即這條信號(hào)通路的活化增強(qiáng)。又檢測(cè)這條信號(hào)通路的上游分子IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)情況，qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-α均能使IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)增加。
　　為了進(jìn)一步探討TNF-α怎樣增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)。與前述相同運(yùn)用信號(hào)通路的抑制劑以及小干擾RNA，檢測(cè)在只用TNF-α刺激時(shí)IF

38、NGR1、IFNGR2的變化，結(jié)果顯示運(yùn)用NF-κB的抑制劑以及小干擾RNA之后，IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)明顯降低。即TNF-α通過(guò)NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)。
　　五、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子具有免疫抵抗作用
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6可以被TNF-α、IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)B7-H1分子，而且TNF-α和IFN-γ對(duì)于B7-H1的表達(dá)具有協(xié)

39、同促進(jìn)作用。將小鼠的腫瘤細(xì)胞用TNF-α和IFN-γ處理使B7-H1分子表達(dá)增加，再將腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)，與未用TNF-α和IFN-γ處理的對(duì)照組相比，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CD3+的細(xì)胞中CFSE的平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即T細(xì)胞的增殖減弱，所以T細(xì)胞的增殖受到抑制。將小鼠的腫瘤細(xì)胞運(yùn)用B7-H1的小干擾處理，再用TNF-α、IFN-γ誘導(dǎo)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CD3+的細(xì)胞中CFSE的平均熒光強(qiáng)度降低，T細(xì)胞增殖基本與對(duì)照組一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

40、示TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子能抑制T細(xì)胞的增殖。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組注射N(xiāo)C小干擾，B組注射N(xiāo)C小干擾并且注射TNF-α和IFN-γ，C組注射B7-H1小干擾并且注射TNF-α和IFN-γ，所以B組B7-H1的表達(dá)最強(qiáng)，六次腫瘤體積測(cè)量的統(tǒng)計(jì)圖顯示，B組腫瘤體積比A、C組大，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)表達(dá)的B7-H1分子具有功能，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃