TNF-α促進B7-H1介導的肝癌細胞的適應性免疫抵抗.pdf

1、目的
　　肝癌(Hepatocellular carcinoma)是僅次于肺癌的世界第二大致死性癌癥，成為危害人類健康的主要疾病之一。肝細胞肝癌是一種典型的炎癥相關(guān)性腫瘤，通常由慢性的肝炎患者發(fā)展而來，慢性炎癥的炎癥微環(huán)境與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。陳列平教授提出腫瘤免疫逃逸的“適應性抵抗假說”，假說指出，腫瘤細胞針對免疫反應，產(chǎn)生了一個適應自身生存的微環(huán)境。腫瘤的產(chǎn)生是幾年甚至數(shù)十年的漫長過程，或許腫瘤組織已經(jīng)將微環(huán)境對腫瘤細胞的免

2、疫反應改造為適應于腫瘤細胞生長的機制。腫瘤組織浸潤的T淋巴細胞分泌細胞因子例如，IFN-γ，IFN-γ作用于免疫細胞可以增強免疫細胞的活性，從而殺傷腫瘤細胞，但同時IFN-γ也可以使腫瘤細胞B7-H1分子表達增加，表達于腫瘤細胞表面的B7-H1分子與T細胞表面的受體PD-1結(jié)合，PD-1是表達在T細胞表面的一種重要的免疫抑制性蛋白，B7-H1與PD-1結(jié)合可以抑制T細胞的活化和細胞因子的產(chǎn)生，導致T細胞功能的耗竭，促進腫瘤細胞的免疫逃逸

3、。
　　隨著免疫療法的不斷發(fā)展進步，特別是近幾年免疫檢查點療法的迅速發(fā)展，人類對于腫瘤的治療取得了很大進步。最新一代的免疫檢查點抑制劑通過阻斷淋巴細胞上PD1與抗原呈遞細胞或者腫瘤細胞上的B7-H1分子的相互作用而發(fā)揮治療效果。FDA已經(jīng)批準B7-H1藥物應用于臨床治療非小細胞肺癌和膀胱癌，其余適應癥正在臨床實驗階段。
　　腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenviroment，TME)是腫瘤細胞賴以生存的復雜環(huán)境，1主要由

4、多種細胞和蛋白質(zhì)組成，不僅起支架作用還含有大量的細胞因子。B7-H1的表達受多種細胞因子的影響，例如IFN-γ、 TNF-α、IL-4和VEGF等，在肝癌的腫瘤微環(huán)境中含有大量的細胞因子，IFN-γ和TNF-α是其中兩種最主要的細胞因子。那么，我們推測在腫瘤微環(huán)境中IFN-γ是否能引起肝癌細胞B7-H1分子的表達？TNF-α是否能引起肝癌細胞B7-H1分子的升高？二者在促進B7-H1升高中有怎樣的聯(lián)系？以及表達增加的B7-H1分子是否具

5、有免疫抵抗功能？
　　針對上述問題我們進行了如下研究，本課題首先研究了IFN叫可以誘導肝癌細胞表達B7-H1分子，以及主要通過的信號通路是JAK/STAT1信號通路。并且發(fā)現(xiàn)TNF-α與IFN-γ可以協(xié)同促進B7-H1分子的表達。進一步研究協(xié)同促進作用的機制，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α通過NF-κB信號通路促進IFNGR1、IFNGR2的表達，進而增強IFN-γ信號通路的活化，導致肝癌細胞B7-H1分子的表達增加。為了進一步研究TNF-α

6、和IFN-γ誘導表達的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能，我們進行了T細胞與腫瘤細胞的共培養(yǎng)實驗和動物實驗，實驗結(jié)果表明協(xié)同誘導的B7-H1分子能抑制T細胞的增殖，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。所以TNF-α和IFN-γ誘導表達的B7-H1分子具有免疫抵抗作用。
　　方法：
　　一、IFN-γγ誘導肝癌細胞表達B7-H1分子
　　（一）B7-H1分子的表達對于IFN-γ有濃度和時間的依賴性
　　肝癌細胞SMMC-772

7、1種板貼壁后，采用不同濃度的IFN-γ誘導B7-H1的表達，將儲存液濃度為100 ng/μl的IFN-γ進行稀釋，使其作用濃度分別為100 ng/ml、50 ng/nl、20 ng/ml、10 ng/ml，誘導細胞24h后收RNA，RT-PCR檢測B7-H1 RNA水平的表達情況。進一步檢測在相同濃度的IFN-γ(50 ng/ml)誘導下，B7-H1表達隨時問的變化，分別誘導0、1、2、3、6、12、24h采用RT-PCR以及qPCR的

8、方法檢測B7-H1分子的表達情況。
　?。ǘ㊣FN-γ誘導肝癌細胞B7-H1分子在RNA以及蛋白水平的表達
　　本實驗所用的肝癌細胞系SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7和Hep3B均購于中國科學院上海細胞庫，這四種肝癌細胞均在50 ng/ml IFN-γ誘導6h的條件下采用RT-PCR方法檢測B7-H1RNA水平的表達。我們選擇其中兩種細胞系 SMMC-7721和HuH-7進行后續(xù)實驗，在50 ng/ml I

9、FN-γ誘導6h的條件下用qPCR方法進一步檢測B7-H1 RNA水平的表達。采用50ng/ml IFN-γ誘導24h后，用PBS清洗一次去除死亡細胞，再用胰酶將細胞消化成單個細胞，清洗去除胰酶，再標記人B7-H1的流式抗體，同時采用同型抗體去除非特異性著色，運用流式細胞術(shù)方法檢測B7-H1蛋白水平的表達。
　　二、 IFN-γ誘導肝癌細胞B7-H1分子表達主要通過的信號通路
　　首先檢測IFN-γ誘導肝癌細胞表達B7-H1

10、分子涉及的信號通路。將SMMC-7721細胞種板貼壁后再加入IFN-γ(50ng/ml)，分別誘導0、5、15、30、60min，Western-blot方法檢測p-STAT1、p-AKT、p-P65、p-P38、p-MEK和p-JNK的活化情況。
　　根據(jù)檢測到的IFN-γ誘導肝癌細胞表達B7-H1分子涉及的信號通路購買信號通路的抑制劑。Western-blot方法顯示涉及的信號通路有NF-κB、PI3K、MEK、JNK、P38

11、、JAK/STAT1。首先采用Western-blot方法檢測各種抑制劑(BAY11-7082(NF-κB)、LY294002(PI3 Kα/δ/β)、U0126(MEK1/2),、SP600125(JNK1/2/3)、SB202190(p38α/β)、Ruxolitinib(JAK1/2))對于對應信號通路的抑制效果以及最適抑制濃度。將SMMC-7721細胞種板貼壁后，提前采用最適濃度抑制劑處理1h，再加入IFN-γ(50ng/ml)

12、同時含有新抑制劑，37℃，培養(yǎng)15min，加入蛋白裂解液收細胞蛋白，采用Western-blot的方法檢測最適抑制劑濃度。
　　檢測IFN-γ誘導肝癌細胞B7-H1分子主要通過的信號通路。將SMMC-7721細胞種板貼壁后，提前運用最適濃度的抑制劑處理1h，再加入IFN-γ(50ng/ml)同時含有新抑制劑，37℃，誘導細胞6h用qPCR方法檢測B7-H1的表達情況。
　　進一步采用小干擾確證IFN-γ誘導肝癌細胞B7-H1

13、分子表達主要通過JAK/STAT1信號通路。所以合成JAK/STAT1信號通路中兩個重要的轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF1的小干擾。首先驗證小干擾的干擾效果，SMMC-7721細胞種板貼壁，第二天大約生長至70％進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h后收RNA，RT-PCR的方法檢測STAT1和IRF1的表達水平，選擇干擾效果好的進行后續(xù)實驗。SMMC-7721細胞種板轉(zhuǎn)染STAT1和IRF1小干擾，24h后加IFN-γ(50 ng/ml)誘導細胞6h，qP

14、CR檢測B7-H1 RNA水平的變化。
　　三、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞表達B7-H1分子
　　SMMC-7721或HuH-7細胞種板貼壁后，分別用TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ（5ng/ml）或者二者同時誘導細胞，6h后收RNA，采用qPCR方法檢測在RNA水平B7-H1分子的表達變化情況。誘導24h后采用流式細胞術(shù)的方法檢測蛋白水平的變化。
　　四、 TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞表

15、達B7-H1分子的機制
　?。ㄒ唬┓治鯰NF-α對于IFN.-γ信號通路的作用
　　運用各種信號通路的抑制劑檢測TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導B7-H1表達過程中信號通路的變化。先將SMMC-7721細胞或HuH-7細胞種板貼壁后用抑制劑處理，37℃，1h，抑制信號通路的活性，再用TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)同時含有抑制劑的培養(yǎng)基誘導細胞，6h后收細胞的RNA，運用qPCR方法檢測B7-H1分子的

16、表達變化情況。
　　為了進一步驗證信號通路的變化，我們運用信號通路的小干擾RNA，siSTAT1、siIRF1、siP65、sic-JUN、sic-FOS和siATF2，12孔板，轉(zhuǎn)染小干擾RNA24h后加TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)誘導細胞，6h后收RNA，運用qPCR方法檢測B7-H1分子的變化情況。
　　將種板貼壁后的細胞用TNF-α（50ng/ml）和IFN-γ(5ng/ml)培養(yǎng)基誘導細

17、胞表達B7-H1分子，24h后收細胞蛋白，用Western-blot方法檢測蛋白水平JAK/STAT1信號通路中JAK2以及p-JAK2、STAT1以及p-STAT1的變化情況。
　　（二）TNF-α對于IFNGR1、IFNGR2表達的影響
　　檢測JAK/STAT1信號通路上游分子IFNGR1、IFNGR2的變化情況。將種板貼壁后的細胞分別用TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ(5ng/ml)或者二者同時誘導細胞表達B

18、7-H1分子，6h后收細胞的RNA，qPCR的方法檢測IFNGR1、IFNGR2表達的變化。
　　為了進一步研究TNF-α增強IFNGR1、IFNGR2表達的機制。首先查閱文獻TNF-α主要的信號通路有NF-κB、MEK、P38、JNK等，運用這些信號通路的抑制劑抑制細胞，將SMMC-7721細胞或HuH-7細胞種板貼壁后提前1h加抑制劑處理(5μM BAY11-7082(NF-κB)、5μM U0126(MEK1/2)、5μM

19、SB202190(p38α/β)、5μM SP600125(JNK1/2/3))，再運用TNF-α(50ng/ml)誘導6h，qPCR的方法檢測IFNGR1、IFNGR2表達的變化。
　　為了進一步確證TNF-α是通過NF-κB信號通路增強IFNGR1、IFNGR2的表達，運用小干擾試驗進行驗證。將SMMC-7721細胞或HuH-7細胞種板貼壁后轉(zhuǎn)染siP65，24h后再用TNF-α(50ng/ml)誘導6h，qPCR的方法檢測I

20、FNGR1、IFNGR2表達的變化。
　　五、TNF噸與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞表達的B7-H1分子具有免疫抵抗功能
　　為了驗證TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞表達的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能，我們進行了腫瘤細胞與T細胞的共培養(yǎng)實驗以及動物實驗。
　?。ㄒ唬┬∈竽[瘤細胞與T細胞共培養(yǎng)實驗
　　1.TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導小鼠肝癌細胞表達B7-H1分子
　　小鼠肝癌細胞Hepa1-6貼

21、壁后，采用IFN-γ、TNF-α或者IFN-γ和TNF-α同時誘導細胞表達B7-H1分子，誘導6h后，收細胞RNA，qPCR方法檢測Hepa1-6細胞表面B7-H1分子RNA水平表達的變化情況。
　　細胞因子誘導Hepa1-6細胞24h，用PBS清洗一次去除死亡細胞，再用胰酶將細胞消化成單個細胞，清洗去除胰酶，標記小鼠B7-H1流式抗體，檢測B7-H1蛋白水平的變化。
　　2.腫瘤細胞種板和轉(zhuǎn)染
　　合成小鼠B7-H1

22、的小干擾，首先檢測小干擾的效果。Hepa1-6細胞種板，12孔板，每孔1.8×105個細胞，第二天細胞生長至70％進行轉(zhuǎn)染小鼠B7-H1小干擾。轉(zhuǎn)染24h，qPCR檢測RNA水平的變化。轉(zhuǎn)染48h，Western-blot檢測蛋白水平的變化。
　　第一天下午小鼠Hepa1-6種板，12孔板每孔1.8×105個。第二天上午生長至70％左右進行轉(zhuǎn)染小鼠B7-H1。
　　3.腫瘤細胞用IFN-γ和TNF-α處理
　　IFN-

23、γ儲存濃度為50ng/μl，作用濃度為5ng/ml，取2μl儲存液溶于18μl的T細胞培養(yǎng)基中，稀釋后濃度為5ng/μl，則每1ml培養(yǎng)基中加1μl IFN-γ稀釋液。TNF-α儲存濃度為100ng/μl，作用濃度為50ng/ml，取8μl儲存液溶于72μl的T細胞培養(yǎng)基中，稀釋后濃度為10ng/μl，則每1ml培養(yǎng)基中加5μl TNF-α稀釋液。上述Hepa1-6細胞種板轉(zhuǎn)，6h換液同時加IFN-γ和TNF-α處理。
　　4.將

24、腫瘤細胞用mitomycinC處理
　　第三天上午，將腫瘤細胞用mitomycinC處理，mitomycinC粉末5mg，加747.65μl DMSO稀釋后濃度為20mM，即6.687μg/μl。設(shè)置濃度梯度確定最適宜mitomycinC處理的作用濃度，將最適濃度的mitomycinC加入上述轉(zhuǎn)染且已用IFN-γ和TNF-α處理的腫瘤細胞培養(yǎng)板中，靜置37℃，30min，清洗三次去除殘留的mitomycinC。
　　5.取小

25、鼠單個核細胞
　　第三天上午取SPF級的6-8W周C57BL/6J小鼠，脫頸處死置于75％酒精中浸泡5min，超凈工作臺中取小鼠脾臟組織，取出后在PBS中清洗2遍。置于70μM的過濾器上先用剪刀剪碎再用5ml針栓研磨，細胞懸液轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，離心1000rpm，5min，用3ml Tris-NH4Cl重懸沉淀裂解紅細胞，靜置3min。加5ml培養(yǎng)基阻止裂紅，1000rpm，5min。用2ml T細胞培養(yǎng)基重懸，取1ml溶于

26、9ml中進行10倍稀釋，計數(shù)。
　　6.CFSE染色
　　CFSE每管粉末50μg，分子量為557.47，每管加18ul DMSO，則懸液的濃度為5mM。設(shè)置濃度梯度選擇較好的CFSE作用濃度。12孔板每孔需單個核細胞1.6×106個，按所需的細胞數(shù)計算所需T細胞懸液的量，離心，1000r/min，5min。用最適濃度的CFSE溶液重懸細胞，室溫靜置7min，加5倍體積含有血清的培養(yǎng)基冰上靜置5min。用大量含血清培養(yǎng)基清洗

27、三次，最后用T細胞培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。
　　設(shè)置濃度梯度選擇適宜的ConA作用濃度，根據(jù)每孔需要T細胞、IFN-γ、TNF-α以及ConA配成細胞懸液，加入到用mitomycinC處理的腫瘤細胞孔中進行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)第二天，每孔各加1ml T細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中是否需要IFN-γ、TNF-α以及ConA都與前述孔中液體相同。
　　7.流式細胞術(shù)檢測
　　共培養(yǎng)72h，采用流式細胞術(shù)方法檢測T細胞的增殖情況。將12孔板中

28、的細胞懸液加入到對應流式管中，用PBS清洗一次將清洗的PBS也加入到對應管中。用胰酶消化殘留細胞，將細胞全部轉(zhuǎn)移到對應的流式管中，1000r/min，5min。用50μl含0.5％血清的PBS重懸。標記CD3抗體4℃，45min。每管加3ml含0.5％血清的PBS清洗一次，1000r/min，5min。用300μl含0.5％血清的PBS重懸，用400目銅網(wǎng)進行過濾，流式細胞術(shù)檢測B7-H1分子在蛋白水平表達的情況。
　?。ǘ﹦游?/p>

29、實驗
　　1.小鼠肝癌細胞系的準備選擇狀態(tài)較好的小鼠肝癌細胞hepa1-6，將hepa1-6細胞大量擴增。
　　2.皮下成瘤
　　將瓶中的細胞用胰酶消化成單個細胞，調(diào)整濃度大約4×106個/ml，選擇SPF級的6-8W周C57BL/6J小鼠，每只小鼠腹部皮下注射100μl細胞懸液，觀察腫瘤的生長情況。
　　根據(jù)腫瘤大小將小鼠平均分為3組，A組注射siNC，B組注射siNC、IFN-γ和TNF-α，C組注射siB7

30、-H1、1FN-γ和TNF-α。
　　3.注射小于擾RNA和細胞因子
　　第一天將粉末小干擾RNA用DEPC水溶解，每只小鼠大約10μg siRNA。運用專用體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑polyplus in vivo-jetPEI進行瘤內(nèi)注射。
　　第二天瘤內(nèi)注射細胞因子TNF-α0.5μg/只，IFN-γ0.05μg/只，小干擾和細胞因子每三天注射一次，小干擾和細胞因子共注射四次。
　　4.腫瘤體積的測量
　　第三天測

31、量腫瘤體積，整個過程腫瘤體積測量六次。
　　結(jié)果：
　　一、 IFN-γ誘導肝癌細胞表達B7-H1分子
　　為了檢測IFN-γ是否能誘導肝癌細胞系B7-H1分子的表達，運用肝癌細胞系SMMC-7721在不同濃度IFN-γ誘導條件下檢測B7-H1的表達情況。結(jié)果顯示在采用不同濃度IFN-γ吖誘導條件下所表達的B7-H1分子的強度不同，隨著IFN-γ濃度增加B7-H1分子的表達量增加，但是IFN-γ到達一定濃度時B7-H1

32、分子的表達強度不再增加，同時結(jié)果顯示50ng/ml的IFN-γ是引起B(yǎng)7-H1表達的最適濃度。相同濃度的IFN-γ(50ng/ml)誘導不同時間所表達的B7-H1分子的強度也不同，在0-6h隨著時間延長B7-H1分子的表達量增強，6h之后隨著時間延長B7-H1分子的表達降低。為了進一步確認上述現(xiàn)象，我們又在另外幾種肝癌細胞SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7、Hep3B中進行了上述實驗。結(jié)果顯示IFN-γ均可以誘導上述幾種肝

33、癌細胞B7-H1分子在RNA水平的表達。又進一步運用流式細胞術(shù)的方法檢測IFN-γ是否可以誘導肝癌細胞B7-H1分子在蛋白水平的表達，結(jié)果顯示在SMMC-7721和HuH-7細胞中，IFN-γ均可以誘導B7-H1分子在蛋白水平的表達
　　二、 IFN-γ誘導肝癌細胞B7-H1的表達主要通過JAK/STAT1信號通路。
　　用Western-blot方法檢測到IFN-γ誘導肝癌細胞表達B7-H1分子涉及多種信號通路。進一步用W

34、estern-blot方法檢測各種抑制劑的最適抑制濃度，在IFN-γ誘導的基礎(chǔ)上運用最適濃度的抑制劑，結(jié)果顯示多條信號通路對于IFN-γ誘導的B7-H1的表達都有影響，但起主要作用的是JAK/STAT1信號通路。
　　轉(zhuǎn)染JAK/STAT1信號通路中主要的轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF1的小干擾后，再用IFN-γ誘導，結(jié)果顯示B7-H1的表達明顯降低，驗證了上述結(jié)論JAK/STAT1信號通路在這個過程中起主要作用。
　　三、 T

35、NF-α與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞B7-H1分子的表達
　　在SMMC-7721細胞和HuH-7細胞中采用TNF-α、IFN-γ或者二者同時誘導細胞表達B7-H1分子，研究發(fā)現(xiàn)，二者同時誘導比單用TNF-α或者IFN-γ時B7-H1分子在RNA水平以及蛋白水平的表達都有明顯升高。所以，TNF-α和IFN-γ在誘導肝癌細胞B7-H1表達過程中二者具有明顯的協(xié)同促進作用。
　　四、 TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞表達B

36、7-H1分子的機制
　　為了研究二者協(xié)同誘導肝癌細胞表達B7-H1分子過程中主要的信號通路，運用抑制劑抑制信號通路的活化，同時運用TNF-α、IFN-γ誘導細胞表達B7-H1分子。結(jié)果顯示，在二者協(xié)調(diào)誘導B7-H1分子表達過程中起主要作用的信號通路還是JAK/STAT1信號通路。為了進一步驗證JAK/STAT1信號通路的作用，運用信號通路的小干擾RNA，發(fā)現(xiàn)運用siSTAT1、siIRF1的小干擾后B7-H1下降較明顯與抑制劑的效

37、果一致。
　　進一步檢測JAK/STAT1信號通路蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)在蛋白水平JAK2、STAT1磷酸化水平增加，即這條信號通路的活化增強。又檢測這條信號通路的上游分子IFNGR1、IFNGR2的表達情況，qPCR檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α均能使IFNGR1、IFNGR2的表達增加。
　　為了進一步探討TNF-α怎樣增強IFNGR1、IFNGR2的表達。與前述相同運用信號通路的抑制劑以及小干擾RNA，檢測在只用TNF-α刺激時IF

38、NGR1、IFNGR2的變化，結(jié)果顯示運用NF-κB的抑制劑以及小干擾RNA之后，IFNGR1、IFNGR2的表達明顯降低。即TNF-α通過NF-κB信號通路增強IFNGR1、IFNGR2的表達。
　　五、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞表達的B7-H1分子具有免疫抵抗作用
　　實驗結(jié)果顯示小鼠肝癌細胞Hepa1-6可以被TNF-α、IFN-γ誘導表達B7-H1分子，而且TNF-α和IFN-γ對于B7-H1的表達具有協(xié)

39、同促進作用。將小鼠的腫瘤細胞用TNF-α和IFN-γ處理使B7-H1分子表達增加，再將腫瘤細胞與T細胞共培養(yǎng)，與未用TNF-α和IFN-γ處理的對照組相比，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示CD3+的細胞中CFSE的平均熒光強度增強，即T細胞的增殖減弱，所以T細胞的增殖受到抑制。將小鼠的腫瘤細胞運用B7-H1的小干擾處理，再用TNF-α、IFN-γ誘導，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示CD3+的細胞中CFSE的平均熒光強度降低，T細胞增殖基本與對照組一致。實驗結(jié)果顯

40、示TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導肝癌細胞表達的B7-H1分子能抑制T細胞的增殖。
　　動物實驗結(jié)果顯示，A組注射NC小干擾，B組注射NC小干擾并且注射TNF-α和IFN-γ，C組注射B7-H1小干擾并且注射TNF-α和IFN-γ，所以B組B7-H1的表達最強，六次腫瘤體積測量的統(tǒng)計圖顯示，B組腫瘤體積比A、C組大，并且有統(tǒng)計學差異。動物實驗結(jié)果顯示，TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導表達的B7-H1分子具有功能，能促進腫瘤細胞的免疫逃