藤梨根活性成分和去氫鴉膽苦醇B協同順鉑抗肺癌細胞增殖作用研究.pdf

1、藤梨根為獼猴桃屬植物中華獼猴桃(Actinidia chinensis Planch)的干燥根，其味苦，性寒，具有清熱利濕、解毒消腫、散瘀通絡等作用。臨床上主要用于肝炎、濕熱黃疸、痢疾、風濕性關節(jié)炎、消化道腫瘤等。本課題對藤梨根進行了系統(tǒng)的化學成分研究，并對所獲得的三萜類成分進行了抗腫瘤活性研究。
　　采用硅膠柱色譜、C18反相柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜以及HPLC等方法，從藤梨根乙醇浸提物的乙酸乙酯部位共分離

2、并鑒定了18個化合物，其結構分別為:ursolic acid(1);2α，3α，24-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid(2);corosolic acid(3); cleomiscosin A(4); isolariciresinal(5);7,8-trans-3,5'-dimethoxy-4'，7-epoxy-8,3'-neolignane-5,9,9'-triol(6);7R,8R-threo-4,

3、7,9,9'-tetrahydroxy-3,3'-dimethoxy-8-O-4'-neolignan(7);7S,8S-threo-4,7,9,9'-tetrahydroxy-3,3'-dimethoxy-8-O-4'-neolignan(8); quercetin(9);3,5,7,3'，5'-pentahydroxyflavan(10); fraxetin(11);scopoletin(12);β-sitosterol(13);

4、daucosterol(14); vanillic acid(15); methyl caffeate(16);2,6-dihydroxy-1,4-benzenedicarboxylic acid dimethyl ester(17);2，3-dihydroxypropyl stearate(18)。其中，化合物4，5，6，7，8，10，11，12，16，17，18為首次從該植物中分離得到。
　　三萜類為藤梨根中主要的抗癌活性成分

5、。采用MTT法對所獲得三萜類成分1，2和3進行抗肺癌細胞增殖活性篩選。結果表明，化合物2和3對肺癌NCI-H292細胞有增殖抑制作用，其IC50值分別為29.28μM和12.20μM;同時，化合物3對肺癌A549細胞也有一定的增殖抑制作用，其IC50值為33.83μM。我們選取藤梨根中含量較大，對肺癌NCI-H292細胞有一定增殖抑制作用，對人臍靜脈內皮 EA.hy926細胞無毒性作用的化合物2(TLG-2)做進一步研究。MTT實驗和細

6、胞實時生長檢測(RTCA)實驗表明TLG-2能夠劑量依賴性和時間依賴性的抑制肺癌NCI-H292細胞增殖;PI單染實驗結果表明TLG-2并不能引起肺癌細胞周期的改變;DAPI染色實驗和AnnexinⅤ/PI雙染實驗結果表明TLG-2能夠誘導肺癌NCI-H292細胞凋亡。進一步的研究發(fā)現，TLG-2能夠誘導細胞內ROS累積、線粒體膜電勢(MMP)降低。Western blot結果表明TLG-2能誘導促凋亡蛋白Bax表達增加，抑凋亡蛋白Bc

7、l-2、Bcl-xL表達減少，細胞色素c（Cytochrome c）釋放，進一步激活caspase級聯反應，導致細胞凋亡。Western blot結果和免疫熒光結果顯示，TLG-2能促使凋亡誘導因子AIF入核，使核內的DNA斷裂，引發(fā)凋亡。綜上所述，TLG-2能夠通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。
　　去氫鴉膽苦醇B(DHB)是從鴉膽子中分離得到的苦木素類化合物，前期的研究表明DHB能夠誘導肺癌A549和NCI-H292細胞凋亡。本課題

8、主要研究DHB在低濃度下能夠促進順鉑(CDDP)誘導的肺癌A549細胞凋亡。RTCA結果表明，DHB能夠增強CDDP誘導的細胞增殖抑制作用;DAPI染色及AnnexinⅤ/PI雙染的結果表明DHB能夠促進CDDP誘導的細胞凋亡;DHB與CDDP聯用，能夠導致細胞MMP降低，細胞色素c釋放以及AIF入核;進一步研究表明，DHB與CDDP聯用能使凋亡相關蛋白的表達發(fā)生改變，如:促凋亡蛋白Bax表達增加，抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達

9、減少;同時還能使活化的caspase-9、caspase-3以及PARP蛋白表達增加。這說明DHB能夠通過線粒體介導的凋亡途徑增強CDDP誘導的細胞凋亡。腫瘤細胞中的Nrf2高表達能夠導致腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。我們檢測到DHB能夠時間依賴性和劑量依賴性的降低A549細胞內Nrf2的表達，同時也能劑量依賴性的降低Nrf2下游蛋白的表達。RT-PCR結果顯示，DHB能劑量依賴性的抑制Nrf2及其下游基因的表達，這可能使得細胞內的ROS