ALX家族基因在人胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)嵴細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）是從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(inner cell mass，ICM)中分離培養(yǎng)得到的一類具有亞全能分化能力的干細(xì)胞，具有自發(fā)向三胚層來源細(xì)胞分化的潛能，并能向特定方向誘導(dǎo)分化，因此hESCs在基因治療、組織工程學(xué)和藥學(xué)研究等眾多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cells，NCCs)是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中短暫存在的一類多能細(xì)胞群。在早期胚

2、胎發(fā)育過程中，NCCs出現(xiàn)在神經(jīng)管隆起的神經(jīng)褶，而后廣泛遷移到各處，在環(huán)境的作用下可向內(nèi)、中、外三個胚層分化成多種細(xì)胞類型，包括感覺神經(jīng)元、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、色素細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞等。由于NCCs可以分化發(fā)育成顱面部絕大部分骨、軟骨以及結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，因此NCCs可以作為體外研究胚胎早期顱面發(fā)育過程和機制的細(xì)胞模型。ALX基因家族屬于同源框基因中PRD家族中的一個亞家族，該基因家族成員包括ALX1（Cart1）、ALX3和

3、ALX4。研究發(fā)現(xiàn)，該家族成員的突變會引起一種特殊的顱面部發(fā)育畸形——鼻額發(fā)育不良(Frontonasal dysplasia，F(xiàn)ND)。許多研究表明ALX基因家族在顱面部發(fā)育中起著重要的作用。但是目前ALX基因家族成員在各種細(xì)胞的表達(dá)水平和功能都尚不明確。
　　研究目的：
　　1.獲取H9hESCs來源NCCs（H9-NCCs）并鑒定其生物學(xué)特性
　　2.明確ALX家族基因在H9-NCCs及其來源分化細(xì)胞中的表達(dá)水平

4、
　　3.明確ALX基因家族成員對H9-NCCs的生物學(xué)特性的影響
　　研究方法和結(jié)果：
　　1.H9hESCs來源NCCs的獲取、培養(yǎng)和鑒定
　　方法：利用體外同時添加Wnt通路激活劑和Smad通路抑制劑的方法將H9hESCs誘導(dǎo)分化形成NCCs（H9-NCCs），觀察H9hESCs及H9-NCCs的細(xì)胞形態(tài)，并通過免疫熒光染色和Real-time PCR方法鑒定H9hESCs及其來源的H9-NCCs的特定標(biāo)志

5、物的表達(dá)。通過添加成神經(jīng)和成間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化液將H9-NCCs分別誘導(dǎo)分化成外胚層來源的外周神經(jīng)細(xì)胞和中胚層來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)并對得到的MSCs進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)分化，檢測H9-NCCs的多向分化能力。
　　結(jié)果：H9hESCs呈克隆樣生長，邊界光滑，結(jié)構(gòu)致密。在誘導(dǎo)7天左右有菱形細(xì)胞從H9hESCs細(xì)胞克隆邊緣爬出，細(xì)胞在3-4天左右融合，標(biāo)記為P0代H9-NCCs;Real-time PCR檢測P4代H9-NCC

6、s標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果顯示與hESCs相比，H9-NCCs高表達(dá)NCCs標(biāo)志基因SOX9、SOX10、P75、HNK-1、AP2和ZIC1，而低表達(dá)hESCs的標(biāo)志基因NANOG和OCT4。免疫熒光染色結(jié)果顯示H9-NCCs高表達(dá)NCCs標(biāo)志物蛋白HNK-1和P75。
　　體外成神經(jīng)誘導(dǎo)分化14天后，H9-NCCs細(xì)胞變長，可觀察到神經(jīng)纖維狀突起的形成。免疫熒光染色結(jié)果顯示，分化得到的細(xì)胞高表達(dá)外周神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ和p

7、eripherin。H9-NCCs在MSCs分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天后可觀察到細(xì)胞從NCCs的菱形轉(zhuǎn)變成MSCs樣的長梭形，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，H9-NCCs來源MSCs（H9-NCC-MSCs）高表達(dá)MSCs表面標(biāo)志物CD90，CD105，CD73和CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD116、CD19、CD45和HLA-DR。此外，H9-NCC-MSCs成骨誘導(dǎo)分化14天后經(jīng)茜素紅染色可觀察到深紅色鈣結(jié)節(jié)存在，但成脂分

8、化14天后油紅O染色未見脂滴形成。
　　2.ALX家族基因在H9hESCs，H9-NCCs及其來源分化細(xì)胞中的表達(dá)水平
　　方法：Real-time PCR檢測H9hESCs、H9-NCCs、外周神經(jīng)細(xì)胞、H9-NCC-MSCs及其來源成骨細(xì)胞中ALX1、ALX3和ALX4的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：在H9hESCs和H9-NCCs中，ALX家族基因表達(dá)量并沒有明顯差異，但ALX1在H9-NCCs中的表達(dá)量顯著高于在H9-

9、NCC-MSCs及其分化得到盼成骨細(xì)胞中。ALX3和ALX4在表達(dá)模式上具有相似性，ALX3在H9-NCC-MSCs特異性的高表達(dá)，而ALX4在外周神經(jīng)細(xì)胞和H9-NCC-MSCs及其分化得到的成骨細(xì)胞中均高表達(dá)。
　　3.過表達(dá)ALX家族基因?qū)9-NCCs的生物學(xué)特性的影響
　　方法：構(gòu)建過表達(dá)ALX家族基因(ALX1，ALX3，ALX4)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并收集病毒感染H9-NCCs，檢測過表達(dá)ALX家族基因

10、對H9-NCCs生物學(xué)特性的影響;利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測細(xì)胞增殖能力;利用AnnexinⅤ/7-AAD染色和流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞凋亡水平;采用Transwell法和結(jié)晶紫染色檢測H9-NCCs的遷移能力。
　　結(jié)果：ALX家族基因與H9-NCCs的增殖能力、遷移能力和凋亡水平有關(guān)。過表達(dá)ALX1，ALX3和ALX4均可顯著提高H9-NCCs的遷移能力。此外，過表達(dá)ALX1還可顯著提高H9-NC

11、Cs的增殖能力;而過表達(dá)ALX4可顯著降低H9-NCCs的增殖能力并且提高其凋亡水平。
　　研究結(jié)論：
　　1.H9-hESCs經(jīng)體外誘導(dǎo)分化形成的H9-NCCs具有NCCs的細(xì)胞形態(tài)并表達(dá)NCCs特定標(biāo)志物，且具有向神經(jīng)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞方向分化的潛能，提示H9-hESCs經(jīng)體外誘導(dǎo)分化形成的H9-NCCs具有NCCs生物學(xué)特性。
　　2.不同的ALX基因在不同分化階段的細(xì)胞中有不同的表達(dá)譜，提示他們在胚胎發(fā)育過程中發(fā)