甘草黃酮微海綿皮膚靶向給藥系統(tǒng)的制備及評價.pdf

1、甘草黃酮具有保肝護肝、抗氧化、抗腫瘤及酶抑制等作用，已經(jīng)作為有效原料藥應(yīng)用于美白化妝品中，但由于甘草黃酮溶解度較差，在皮膚的局部藥物濃度偏低，導(dǎo)致美白作用不佳。微海綿是一種載體系統(tǒng)，能夠提高藥物在皮膚局部的滯留量，延長藥物的釋放時間，提高局部的藥物濃度，還能提高藥物在制劑中的穩(wěn)定性。將甘草黃酮與微海綿相結(jié)合，對于治療皮膚局部性疾病或美白祛斑具有重要的意義。
　　研究目的：
　　在課題組對微海綿研究的前期基礎(chǔ)上，將甘草黃酮與微

2、海綿技術(shù)相結(jié)合，制備成甘草黃酮微海綿，以期提高甘草黃酮在皮膚局部的滯留量，提高局部的藥物濃度，使藥物在皮膚局部中形成藥物貯庫，增強甘草黃酮美白祛斑的作用。
　　研究方法：
　　1.甘草黃酮微海綿處方前研究
　　建立同時測定甘草黃酮中六個主要成分的含量測定方法;采用正辛醇-水系統(tǒng)，對其油水分配系數(shù)進行考察;考察甘草黃酮在不同溶劑中的平衡溶解度，篩選合適的接收液。
　　2.甘草黃酮微海綿制備工藝研究
　　以聚乙

3、烯醇用量，藥物/乙基纖維素的比例和攪拌速度作為考察因素，以微海綿得率、藥物包封率和分散系數(shù)為效應(yīng)值，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法和Design-Expert8.0軟件設(shè)計并篩選最優(yōu)制備工藝。利用掃描電鏡和Mastersize2000激光衍射粒度分析儀觀察微海綿的形態(tài)及測定其粒徑大小。
　　3.甘草黃酮微海綿體外釋藥行為研究
　　將甘草黃酮及甘草黃酮微海綿制備成軟膏，利用Franz擴散池，以含30％PEG-400的生理鹽水作為接收液

4、，在裸鼠皮膚上分別給予等量兩種軟膏后，考察甘草黃酮中六個成分皮膚滲透行為的差異，并計算其滲透速率。將得到的釋放曲線采用不同的模型擬合方程，對兩種軟膏的藥物釋放行為進行分析。此外，分別測定體外透皮4h、8h、12h和24h后皮膚內(nèi)甘草黃酮中六個成分的滯留量，比較兩種軟膏在皮膚內(nèi)滯留量的差異。
　　4.甘草黃酮美白藥效學(xué)評價
　　本文選用了大鼠黑化模型和小鼠黑素瘤細(xì)胞來評價和闡述甘草黃酮的美白作用及其初步的作用機制。通過紫外線照

5、射建立大鼠黑化模型并進行皮膚給藥進行治療，隨后對不同分組的大鼠皮膚進行氨銀染色檢測皮膚內(nèi)黑色素含量，以及通過Western Blot試驗檢測酪氨酸酶的表達情況，評價甘草黃酮的美白祛斑作用。
　　選擇小鼠黑色素瘤細(xì)胞為細(xì)胞模型，通過MTT法探究甘草黃酮對細(xì)胞的細(xì)胞毒性，氫氧化鈉裂解試驗探究甘草黃酮對細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的影響，體外氧化L-DOPA反應(yīng)試驗探究甘草黃酮對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響，Westerb-Blotting實驗探究甘草

6、黃酮對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶蛋白表達的影響，初步闡述甘草黃酮美白祛斑的作用機制。
　　研究結(jié)果：
　　1.甘草黃酮微海綿處方前研究
　　甘草黃酮含量測定方法的HPLC色譜條件為：Agilent5HC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，乙腈-甲醇-0.2％磷酸水(15∶10∶75)梯度洗脫，流速：1.0ml/min;柱溫：30℃;進樣量：10μl;檢測波長：300nm。
　　分別建立了以甲醇和含30％PEG-40

7、0的生理鹽水為溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且六個成分在濃度范圍內(nèi)與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
　　甘草黃酮六個成分在含30％PEG-400的生理鹽水中能夠全部溶解，故選擇含30％PEG-400的生理鹽水作為透皮接收液。甘草黃酮中甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A和光甘草定的油水分配系數(shù)分別為0.1958、0.3983、0.7809、0.6574、1.672和0.4602。
　　2.甘草黃酮微海綿制備工藝研究
　　最

8、優(yōu)制備工藝以最高得率、最高藥物包封率和最小分散系數(shù)為評價指標(biāo)，利用Design-Expert8.0軟件對各個因素水平進行分析，得到最優(yōu)工藝的條件分別為：PVA的用量為2.69％，藥物/乙基纖維素的比例為6∶1，攪拌速度為1100rpm。最優(yōu)工藝下制備的微海綿得率為60.76±0.45％，微海綿的包封率為52.84±3.43％，分散系數(shù)為1.06±0.12。微海綿表面積平均粒徑為11.01±0.98μm，體積平均粒徑為24.28±1.09

9、μm，粒徑大小和分散系數(shù)測定結(jié)果顯示甘草黃酮微海綿粒徑分布均勻。
　　3.甘草黃酮微海綿體外釋藥行為研究
　　對甘草黃酮的釋放動力學(xué)進行分析發(fā)現(xiàn)，甘草黃酮中六個成分從兩種軟膏中的釋放均符合零級動力學(xué)方程。甘草黃酮軟膏中甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A和光甘草定的滲透速率分別為0.55±0.16μg·h-1·cm-2、0.72±0.04μg·h-1·cm-2、1.38±0.02μg·h-1·cm-2、0.67±

10、0.05μg·h-1·cm-2、2.73±0.14μg·h-1·cm-2、1.00±0.23μg·h-1·cm-2;甘草黃酮微海綿軟膏中甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A和光甘草定的滲透速率分別為1.75±0.02μg·h-1·cm-2、1.02±0.01μg·h-1·cm-2、1.75±0.14μg·h-1·cm-2、1.40±0.13μg·h-1·cm-2、3.12±0.27μg·h-1·cm-2、1.81±1.04μ

11、g·h-1·cm-2。甘草黃酮微海綿軟膏中六個成分的滲透速率均高于甘草黃酮軟膏。
　　由甘草黃酮軟膏組和甘草黃酮微海綿軟膏組中皮膚滯留量的分析結(jié)果可以看出，兩組之間的皮膚滯留量均具有顯著性差異，而且甘草黃酮微海綿軟膏組的皮膚滯留量均明顯高于甘草黃酮軟膏組。
　　4.甘草黃酮美白藥效學(xué)研究
　　氨銀染色和Western Blot試驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組的黑素含量明顯增加，酪氨酸酶的表達也出現(xiàn)了上調(diào)現(xiàn)象，說明

12、造模成功。與模型組相比，使用熊果苷或甘草黃酮后，大鼠皮膚內(nèi)的黑素含量均呈現(xiàn)下降的現(xiàn)象，酪氨酸酶的表達也出現(xiàn)了下調(diào)，說明熊果苷和甘草黃酮對紫外線誘導(dǎo)的大鼠皮膚中的酪氨酸酶均有抑制作用，進而抑制了黑色素的合成，降低了皮膚表面黑色素的含量。與甘草黃酮普通軟膏相比，使用甘草黃酮微海綿軟膏后，該組的大鼠皮膚中黑色素的含量更低，抑制酪氨酸酶的表達作用更強，說明將甘草黃酮制備成甘草黃酮微海綿后，能在皮膚中形成局部藥物貯庫，提高了甘草黃酮在皮膚中的藥物

13、濃度，進而增強甘草黃酮的美白作用。
　　細(xì)胞毒性試驗結(jié)果顯示，當(dāng)甘草黃酮的藥物濃度高于400μg/ml時，藥物對細(xì)胞具有一定的毒性。而黑色素含量測定和酪氨酸酶活性測定結(jié)果顯示，隨著甘草黃酮藥物干預(yù)濃度的增大，酪氨酸酶活性及黑色素相對含量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。Western Blotting試驗結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后，隨著時間不和藥物濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的蛋白表達均呈現(xiàn)下降的趨勢，其中最佳的藥物干預(yù)時間是24h，最佳的藥物濃度為

14、200μg/ml。對細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)及其磷酸化測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草黃酮干預(yù)60min后，ERK的磷酸化激活。
　　研究結(jié)論：
　　1.HPLC同時測定甘草黃酮六個成分的含量測定方法線性關(guān)系良好，儀器精密度良好。甘草黃酮六個成分的皮膚擴散性能較差。甘草黃酮六個成分在含30％PEG-400的生理鹽水中的溶解度能符合體外透皮試驗的要求。
　　2.甘草黃酮微海綿制備工藝研究表明，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法篩選甘草黃酮微海

15、綿的制備工藝是有效、可靠的，通過Design-Expert8.0軟件能直觀地分析PVA用量、藥物/乙基纖維素的比例以及攪拌速度對甘草黃酮微海綿得率、藥物包封率和粒徑分布均勻性的影響。
　　3.體外釋藥行為研究表明，將甘草黃酮制備成微海綿制劑，能夠提高甘草黃酮透過皮膚角質(zhì)層的滲透速率，增加藥物的皮膚滯留量，且藥物持續(xù)釋放時間長。
　　4.美白藥效學(xué)研究表明，微海綿制劑能增強甘草黃酮抑制酪氨酸酶的作用，進而降低黑色素的含量。細(xì)胞