miR-365靶向下調(diào)BAX抑制凋亡促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的初步研究.pdf

1、目的:
　　非黑色素瘤皮膚癌(Non-melanoma skin cancer，NMSC)是人類常見的惡性腫瘤之一，包括基底細(xì)胞癌(Basal cell carcinoma，BBC)和鱗狀細(xì)胞癌(squamouscell carcinoma of skin，SCC)等。SCC是源于上皮組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性腫瘤，包括宮頸癌、食道癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌等(squamous cell carcinoma of skin，CSCC)。CS

2、CC是發(fā)生在表皮（或粘膜）上皮細(xì)胞的一種惡性腫瘤，它的發(fā)病率低于基底細(xì)胞癌，但是轉(zhuǎn)移率和死亡率較高，男性發(fā)病多于女性，好發(fā)于臉部、手部和前臂。已有的報(bào)道m(xù)icroRNAs參與CSCC發(fā)生發(fā)展。microRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA小分子，microRNA與靶mRNA的3'UTR部分序列特異性堿基配對，會抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。不同microRNA在不同的癌癥中表達(dá)不同，同一個(gè)microR

3、NA在不同的癌癥表達(dá)也存在著差異，例如miR-365在CSCC及原發(fā)性乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，而miR-365在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌及黑色素細(xì)胞瘤卻表達(dá)下調(diào)。已知多種microRNA可調(diào)控BAX表達(dá)。BAX屬于BCL-2家族中的促凋亡蛋白，BAX蛋白的過表達(dá)、低表達(dá)和活化都會導(dǎo)致腫瘤生物學(xué)功能的改變。本課題的研究目的是探討miR-365在CSCC中的生物學(xué)作用，進(jìn)一步明確miR-365與BAX分子之間的調(diào)控機(jī)制，為CSCC的臨床治療提供理

4、論依據(jù)和新的治療策略。
　　方法:
　　①采用qPCR的方法檢測人永生化表皮細(xì)胞與CSCC細(xì)胞系、人正常表皮組織與人皮膚鱗癌組織以及裸鼠移植瘤中miR-365和BAX的表達(dá)，采用WesternBlot檢測BAX在蛋白水平上的表達(dá);②免疫組化檢測人正常表皮組織與人皮膚鱗癌組織以及裸鼠移植瘤中的BAX表達(dá);③雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)等檢測miR-365與BAX之間的靶向調(diào)控關(guān)系;④使用CCK8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測A

5、431細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC、siBAX后，細(xì)胞的增殖能力、修復(fù)能力、遷移運(yùn)動和侵襲能力的變化;⑤用流式細(xì)胞儀檢測A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC、siBAX后，對細(xì)胞凋亡的影響;⑥Tunnel實(shí)驗(yàn)檢測皮下移植瘤細(xì)胞中的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　①與對照相比，miR-365在CSCC細(xì)胞系中高表達(dá)(P＜0.001)，BAX在mRNA水平以及蛋白水平低表達(dá)(P＜0.001)。②CSCC組織中，與正常表皮組織相比，BAX在mRNA水平以及蛋白水平低

6、表達(dá)(p＜0.01)。免疫組化中BAX的陽性率低于正常表皮組織(P＜0.01)。③雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，BAX.3'UTR-WT組的熒光強(qiáng)度明顯低于BAX3'UTR-Mutant組(P＜0.01)。④分別將miR-365minic和antagomiR-365轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞。miR-365組中miR-365表達(dá)上調(diào)，BAXmRNA水平及蛋白水平表達(dá)下調(diào)(P＜0.001);相反，antagomiR-365組中miR-365表達(dá)下調(diào)，BAX

7、 mRNA水平及蛋白水平表達(dá)上調(diào)(P＜0.001)。⑤轉(zhuǎn)染NC、siBAX至A431細(xì)胞中，與對照NC相比，siBAX組細(xì)胞的增殖能力(P＜0.001)、修復(fù)能力(P＜0.05)、遷移（P＜0.001）及侵襲(P＜0.001)能力均增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少(P＜0.05)。⑥裸鼠皮下成瘤初步實(shí)驗(yàn)揭示，與NC組相比，siBAX處理組的生長速度更快(P＜0.05)，腫瘤體積更大;種植瘤中BAX在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均低于對照組;免疫組化中，