MiR-484靶向HIPK1促進肝纖維化發(fā)生發(fā)展的研究.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化是指當肝臟受到各類有害因素的損傷時，細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)沉積而導致肝臟正常結構和功能發(fā)生改變的病理過程。多種慢性肝病均可經此過程并最終進展為預后極差的肝硬化和肝癌。所以，針對肝纖維化的早期診斷和治療成為研究的重中之重。而目前為止，肝穿刺仍為診斷肝纖維化的金標準，但因其有創(chuàng)性而得不到廣泛、及時實施，在一定程度上耽誤了患者的早期診治。雖已有肝纖維化無創(chuàng)性早期診斷的方法，但

2、均不十分理想，新的更有效的手段亟待被發(fā)現，這就有必要對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機制行進一步深入研究。
　　miRNA(microRNA)是一段大小約20～25個核苷酸序列的小分子片段，其在真核細胞中廣泛存在，可通過負向調控其靶基因參與多種疾病的發(fā)生和進展，且在內分泌、心血管和腫瘤等多種研究領域受到廣泛關注。目前亦有多種研究表明miRNA與肝纖維化發(fā)生密切相關，其可通過影響肝星狀細胞(hepatic stellated cell，HS

3、C)的活化、增殖、凋亡、遷移等細胞學功能，在肝纖維發(fā)生及進展過程中起促進或抑制作用。本課題組多年來一直從事miRNAs與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機制研究，前期工作發(fā)現:miR-484在DMN誘導的大鼠肝纖維化模型中呈顯著性差異表達，且相關文章已經發(fā)表。本研究為進一步探討miR-484是否對HSC細胞功能學產生影響，通過提取原代HSC，檢測到miR-484在HSC自然活化過程中表達呈上升趨勢。并通過生物信息學和雙熒光素酶報告基因實驗篩選并驗

4、證得知HIPK1（homeodomain interacting protein kinase1，同源結構域交互蛋白激酶1）為miR-484的靶基因。已有研究表明，HIPK1可調控細胞增殖、分化、凋亡等多種生物過程。本研究中同樣發(fā)現miR-484可通過靶向HIPK1促進HSC活化并抑制其凋亡，且在此過程中伴有Wnt/β-catenin信號通路的激活，若在疾病早期對miR-484的表達進行抑制，或許可阻遏肝纖維化進程。
　　研究目的

5、：
　　本研究在前期工作的基礎上，旨在進一步探討miR-484參與肝纖維化形成的具體分子機制。共包括三個部分:（一）檢測miR-484在大鼠原代HSC自然活化過程中的表達變化;（二）miR-484靶基因的篩選及驗證;（三）miR-484對HSC活化和凋亡的信號通路機制研究。
　　研究方法：
　　一、檢測miR-484在大鼠原代HSC自然活化過程中的表達變化
　?。ㄒ唬┨崛〈笫笤鶫SC，以自發(fā)熒光實驗鑒定所提細胞

6、的純度;將培養(yǎng)2天內的細胞作為靜止態(tài)，培養(yǎng)至14天的細胞作為完全活化態(tài)，并用免疫熒光實驗鑒定細胞狀態(tài);
　?。ǘ﹒RT-PCR檢測原代細胞不同時期miR-484的表達水平。
　　二、 miR-484靶基因的篩選及驗證
　?。ㄒ唬┮詍iR-484為關鍵詞，在microRNA.org、 miRbase、TargetScan等網站進行了靶基因預測，并對感興趣的靶基因進行Gene ontology(GO)分析，發(fā)掘其可能參與

7、的功能;
　?。ǘ╇p熒光素酶報告基因驗證miR-484與HIPK1之間是否存在直接靶向關系。
　?。ㄈ├肏SC-T6細胞株進行轉染實驗，將miR-484 inhibitor/mimics及其陰性對照轉染入細胞48h后，提取細胞總蛋白。利用Western Blot技術檢測HIPK1是否被miR-484負向調控;
　　三、 miR-484對HSC活化和凋亡的信號通路機制研究
　?。ㄒ唬┰贖SC-T6細胞株中轉染

8、miR-484 inhibitor后，qRT-PCR和Western Blot檢測不同分組之間肝纖維化相關指標α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型膠原(TypeⅠ collagen，colI)表達變化;
　　（二）在HSC-T6細胞株中轉染miR-484 inhibitor后，利用qRT-PCR和WesternBlot技術檢測Wnt-3a、Wnt-5a、β-catenin表達是否發(fā)生相

9、應改變，以檢測miR-484對HSC細胞功能的調控，是否通過Wnt/β-catenin信號通路實現;
　?。ㄈ〢nnexinⅤ-FITC/PI雙染法用以檢測不同分組之間細胞凋亡的差異。
　　四、統(tǒng)計學方法:計量資料用均數±標準差表示;兩組數據之間比較采用T檢驗;統(tǒng)計軟件采用SPSS21.0;統(tǒng)計學顯著性定義為P＜0.05。
　　研究結果：
　　一、 miR-484在大鼠原代HSC自然活化過程中的表達變化

10、　?。ㄒ唬┳园l(fā)熒光實驗鑒定結果提示所提原代HSC的純度可達90％以上，2天內靜止態(tài)的細胞呈橢圓形，脂質含量豐富，在328 nm波長紫外光照射下，可發(fā)射出黃綠色熒光;培養(yǎng)至14天達到完全活化狀態(tài)，細胞延展生長，呈星狀;免疫熒光實驗顯示活化態(tài)細胞中α-SMA表達量明顯升高;
　?。ǘ﹒RT-PCR結果提示，相對于靜止態(tài)，活化態(tài)HSC中miR-484表達呈顯著性升高(P＜0.05)。
　　二、 miR-484靶基因的篩選與驗證<

11、br>　?。ㄒ唬┥镄畔W分析結果提示，HIPK1與miR-484在3'UTR區(qū)域存在兩個結合位點;
　?。ǘ╇p熒光素酶報告基因驗證miR-484與HIPK1之間確實存在靶向關系;
　　（三）Western Blot結果表明，在HSC-T6細胞株中轉染miR-484 inhibitor后，HIPK1在蛋白水平表達明顯上調;而轉染miR-484 mimics后，HIPK1在蛋白水平表達明顯下調。
　　三、 miR-48

12、4對HSC活化和凋亡的信號通路機制研究
　?。ㄒ唬┫鄬τ陉幮詫φ战M，轉染miR-484 inhibitor后48h，HSC-T6細胞株中α-SMA和colI在mRNA和蛋白水平表達均明顯下降(P＜0.05);而空白對照組與陰性對照組表達則無明顯差異(P＞0.05);
　?。ǘ┺D染miR-484 inhibitor后，Wnt/β-catenin信號通路相關分子Wnt-3a、 Wnt-5a、β-catenin表達下降(P＜0.

13、05);
　　（三）人為下調miR-484后，流式細胞儀檢測得HSC-T6細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。
　　結論：
　　一、 miR-484在原代HSC自然活化過程中表達升高;
　　二、 HIPK1是miR-484的直接靶基因;
　　三、 miR-484靶向HIPK1促進HSC活化并抑制其凋亡，使得細胞外基質合成增多，促進肝纖維化形成及進展;
　　四、 miR-484靶向HIPK1對HSC細胞