miRNA-34a靶向ACSL1對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、本研究擬通過探索miR-34a在臨床肝纖維化病程及原代肝星狀細(xì)胞(HSC)自然活化增殖過程中的生物學(xué)特性，應(yīng)用分子生物學(xué)方法分析并驗證miR-34a的靶基因，進(jìn)而研討miR-34a通過靶基因在肝纖維化病程中的調(diào)控機(jī)制，為肝纖維化的早期診斷和治療提供一個新的分子靶點(diǎn)。
　　第一部分:miR-34a在肝纖維化進(jìn)程中的表達(dá)及功能研究
　　目的:檢測不同分期臨床肝纖維化組織標(biāo)本和原代HSC自然活化增殖過程中miR-34a表達(dá)，分析m

2、iR-34a與肝纖維化進(jìn)程和HSC活化程度的相關(guān)性。
　　方法:1、收集臨床肝纖維化組織標(biāo)本，應(yīng)用HE染色、Masson染色和Van Gieson(VG)染色對臨床肝纖維化組織進(jìn)行分期，qRT-PCR檢測miR-34a在臨床不同分期肝纖維化組織中的表達(dá)差異。2、Friedman二步分離法提取大鼠原代HSC并進(jìn)行體外培養(yǎng)，臺盼藍(lán)染色法、自發(fā)熒光實驗及免疫雙熒光實驗鑒定細(xì)胞活性、細(xì)胞純度及細(xì)胞狀態(tài)，qRT-PCR檢測原代HSC體外培養(yǎng)

3、到第2d、第7d和第14d時miR-34a的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1、依據(jù)METAVIR肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用HE染色、Masson染色和VG染色將臨床肝纖維化組織分為F0期、F1期、F2期、F3期、F4期。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):與F0期肝組織相比，F(xiàn)1期、F2期、F3期、F4期肝纖維化組織中miR-34a的基因量表達(dá)分別增加6.2倍、21.3倍、32.4倍、39.8倍，P＜0.05。2、應(yīng)用Fridman二步法提取大鼠原代HS

4、C，通過臺盼藍(lán)染色法、自發(fā)熒光實驗鑒定原代HSC細(xì)胞純度＞95％，細(xì)胞存活率＞95％;應(yīng)用免疫雙熒光實驗鑒定證實體外培養(yǎng)到第2d的HSC為靜止態(tài)，體外培養(yǎng)到第14d的HSC為活化態(tài)。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):與體外培養(yǎng)2d的HSC（靜止態(tài)）相比，體外培養(yǎng)到第7d（半活化態(tài)）的HSC中miR-34a表達(dá)量增加48.6倍，P＜0.05，體外培養(yǎng)到第14d的HSC（活化態(tài)）中miR-34a的表達(dá)量增加192.0倍，P＜0.05。
　　結(jié)論

5、:1、miR-34a的基因表達(dá)量隨著臨床肝纖維化進(jìn)程逐漸增加，與肝纖維化病程正相關(guān)。2、miR-34a的基因表達(dá)量隨著原代HSC的自然活化增殖逐漸增加，與HSC的活化程度正相關(guān)。
　　第二部分:miR-34a靶基因的篩選與驗證
　　目的:應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析和篩選出miR-34a靶基因長鏈脂酰輔酶A合成酶1（Acy1-CoA synthetase long-chain1，Acsl1），驗證miR-34a與Acsl1的靶向關(guān)

6、系，研究Acsl1在臨床各期肝纖維化組織和原代HSC自然活化增殖過程中的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　方法:1、以mo-miR-34a-5p為檢索詞，在microRNA.org、PicTar、TargetScan、miRDB及miRbase5個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因預(yù)測，然后在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因的功能顯著性(GO)分析，KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通道的pathway分析，結(jié)合本課題組前期預(yù)實驗利用動物肝纖維化組織所獲取的

7、miRNA-mRNA表達(dá)譜，構(gòu)建miRNA-Gene-Network，篩選出miR-34a-5p的靶基因。2、應(yīng)用pMIR-REPORT載體構(gòu)建Acsl1野生型（WT）和突變型(MUT)質(zhì)粒，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-34a與Acsl1的靶向關(guān)系。3、應(yīng)用qRT-PCR、Western Blot和免疫組化檢測ACSL1在臨床不同分期肝纖維化組織以及原代HSC自然活化增殖過程中的表達(dá)差異，分析其與miR-34a表達(dá)的相關(guān)性。

8、>　　結(jié)果:1、以rno-miR-34a-5p為檢索詞，在microRNA.org、PicTar、TargetScan、miRDB及miRbase5個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因預(yù)測，取每個數(shù)據(jù)庫前50的預(yù)測結(jié)果的交集為可能的靶基因。然后在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因的GO分析，KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通道的pathway分析。結(jié)合本課題組預(yù)實驗利用動物肝纖維化組織得到的miRNA-mRNA表達(dá)譜，構(gòu)建出miRNA-Gene-Netwo

9、rk，發(fā)現(xiàn)Acsl1位于該網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控中心，受miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-19a、miR181a等5個miRNA的共同調(diào)控，因此Acsl1可能為mo-miR-34a的靶基因。2、通過生物信息技術(shù)分析，我們預(yù)測miR-34a-5p位點(diǎn)上有7個核糖核苷酸與Acsl13’-UTR的161-167位點(diǎn)互補(bǔ)，PCR擴(kuò)增3’-UTR(Acsl1)序列構(gòu)建于載體luciferase下游的MluI和HindⅢ，構(gòu)建出Acsl1

10、 WT質(zhì)粒。再利用點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建入pMIR-REPORT luciferase載體的螢光素酶報告基因下游，構(gòu)建出Acsl1 MUT質(zhì)粒。與共轉(zhuǎn)染Acsl1 WT質(zhì)粒和NC序列的293T工具細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染Acsl1 WT質(zhì)粒和miR-34a inhibitor的工具細(xì)胞的Firefly luciferase/Renialla luciferase比值明顯上升，P＜0.05，說明miR-34a對Acsl1有直接負(fù)向調(diào)控

11、作用。與共轉(zhuǎn)染Acsl1 MUT質(zhì)粒和NC序列的工具細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染Acsl1 MUT質(zhì)粒和miR-34a inhibitor后，其Firefly luciferase/Renialla luciferase比值無明顯差異，P＞0.05，該結(jié)果說明當(dāng)Acsl13’端161-167位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變后，miR-34a不能與之特異結(jié)合，對其負(fù)向調(diào)控作用消失。Acsl1是mo-miR-34a-5p的直接作用靶點(diǎn)。3、qRT-PCR檢測結(jié)果顯示:F

12、1期、F2期、F3期、F4期臨床肝纖維化組織中ACSL1的mRNA表達(dá)量分別為F0期肝組織的72.2％、44.4％、32.0％、22.2％，P＜0.05。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:ACSL1在肝纖維化組織中mRNA表達(dá)量與miR-34a負(fù)相關(guān)，R2=0.8221，P＜0.05。Western Blot檢測和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:從F0期到F4期，ACSL1的蛋白表達(dá)量逐步減少。
　　4、qRT-PCR檢測結(jié)果顯示:與體外培養(yǎng)到第2d

13、的靜止態(tài)HSC相比，體外培養(yǎng)到第7d、第14d時，Acsl1的mRNA表達(dá)量分別下降22.3％、55.4％，P＜0.05。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:Acsl1在HSC中的表達(dá)量與miR-34a負(fù)相關(guān)，R2=0.9612，P＜0.05。Western Blot檢測結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)到第2d、第7d、第14d的Acsl1的蛋白表達(dá)量逐步減少。
　　結(jié)論:1、Acsl1為miR-34a的靶基因。2、隨著臨床肝纖維化進(jìn)展，ACSL1的基因和蛋白

14、表達(dá)水平明顯降低，ACSL1的mRNA表達(dá)量與miR-34a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。3、隨著HSC的活化，Acsl1的mRNA和蛋白表達(dá)水平逐步下降，HSC細(xì)胞中Acsl1的mRNA表達(dá)量與miR-34a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　第三部分:miR-34a靶向Acsl1參與HSC活化增殖的相關(guān)研究
　　目的:驗證miR-34a靶向Acsl1對HSC活化增殖的生物學(xué)行為作用。
　　方法:1、以aH-SC為研究對象，將miR-34a inh

15、ibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中，檢測Acsl1和肝纖維化指標(biāo)Ⅰ型膠原(ColI)和α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。2、利用aHSC構(gòu)建Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株，檢測肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的mRNA和蛋白表達(dá)水平，判斷Acsl1對肝纖維化進(jìn)程的影響。3、回復(fù)實驗(rescue assay)進(jìn)一步驗證miR-34a靶向Acsl1對HSC表型的調(diào)控。
　　結(jié)果:1、與體外培養(yǎng)到第2d的HSC相比，體外培養(yǎng)到第14d的HSC

16、中ColI的表達(dá)增加8.7倍，α-SMA的表達(dá)增加2.7倍，P＜0.05。Western Blot結(jié)果顯示:與體外培養(yǎng)到第2d的HSC相比，ColI和α-SMA的蛋白表達(dá)亦出現(xiàn)顯著增加。2、與NC組比較，aHSC轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后Acsl1的mRNA表達(dá)量增加1.7倍，P＜0.05，ColI和α-SMA的mRNA表達(dá)量分別減少41.8％和63.5％，P＜0.05;而blank組與NC組相比，Acsl1、ColI和α

17、-SMA的mRNA表達(dá)量無顯著差異，P＞0.05。inhibitor組中Acsl1的蛋白表達(dá)量較NC組顯著增加，ColI和α-SMA的蛋白表達(dá)量顯著下降，而NC組和blank組中Acsl1、ColI和α-SMA蛋白表達(dá)差異不顯著。4、Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染NC和miR-34a inhibitor后，兩組Col1和α-SMA的蛋白表達(dá)無顯著差異;與轉(zhuǎn)染NC序列的干擾對照細(xì)胞株相比，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的干擾對照