采用AT方案新輔助化療的Luminal A型乳腺癌患者血漿外泌體microRNA特征研究.pdf

1、外泌體(exosome)為細胞膜或多囊泡胞內體與細胞膜融合過程中所產生的分子直徑30～100nm的小囊泡，在真核生物的血液、尿液和唾液等多種甚至全部體液中廣泛分布。近年來針對外泌體及其所含microRNA(miRNA)的研究發(fā)現(xiàn)，其與乳腺癌的發(fā)病及預后關系密切，并且可能在乳腺癌的早期診斷和臨床評估中發(fā)揮重要作用。截至目前，已有大量針對乳腺癌細胞外泌體miRNA的研究發(fā)現(xiàn)其異常表達與腫瘤的發(fā)展階段和耐藥性息息相關。遺憾的是，大多數(shù)研究都在

2、細胞系中進行，其miRNA的變化并不能完全代表患者體內miRNA水平的波動。此外由于外泌體的研究是近年來新興的熱點，受制于樣本數(shù)量及實驗規(guī)模，目前多數(shù)的研究仍基于既往血漿或病理組織中的結果展開。因此在本研究中，將直接針對乳腺癌患者血漿外泌體的研究，采用二代測序的方法對外泌體miRNA的調控網絡進行全面、深入的分析，篩選其可能的核心靶點，并嘗試建立與療效、預后等臨床事件的關聯(lián)。
　　目的：1)探索不同方法提取外泌體miRNA的差異，

3、構建有臨床應用價值的實驗方法;
　　2)明確外泌體miRNA在新輔助化療效果差異的Luminal A型乳腺癌患者中的不同表達水平以及用藥前后的波動，分析其可能作用的靶基因及其功能
　　3)利用生物信息學分析乳腺癌患者血漿外泌體mirna的總譜，進一步明確其調控的靶基因的功能聚類，并基于大數(shù)據驗證差異表達的靶基因。
　　方法：1)用超速離心法或試劑盒沉降法提取晚期乳腺癌患者血漿中的外泌體;通過透射電鏡鑒定外泌體及West

4、ern Blot法驗證外泌體標志蛋白，明確外泌體在乳腺癌患者血漿中的分布;
　　2)用試劑盒提取外泌體總RNA，針對miRNA構建文庫，進行二代測序;比較療效不同的接受紫杉醇聯(lián)合表柔比星化療的晚期LuminaA型乳腺癌患者血漿外泌體中miRNA分布水平的差異;
　　3)結合DIANA Tools、GO、KEGG等數(shù)據庫分析血漿外泌體miRNA的靶基因及下游信號通路。
　　結果：1)由試劑盒沉降外泌體并繼而使用試劑盒提取

5、總RNA較傳統(tǒng)的超速離心分離外泌體以及Trizol提取RNA，可獲得相對更高的得率，在血樣保存時間較長，總量較少的情況下仍能獲得較滿意外泌體RNA提取結果;
　　2)通過文庫構建及二代測序獲得的所有樣本的小RNA片段與miRBase數(shù)據庫對比，共鑒定出1446種已知miRNA，表達量最高的miRNA中，部分如miR16、miR22已被證實在乳腺癌患者的血漿和組織中高表達;
　　3)利用edgeR分析PR及SD病人樣本間miR

6、NA的差異表達，篩選出9個在SD組中表達顯著上調的miRNA，13個明顯表達下調，miR454在Kaplan Meire plot數(shù)據庫中與總生存期相關（p小于0.05）;而針對5位PR病人化療前及化療中miRNA的測定發(fā)現(xiàn)共6個miRNA呈下降趨勢，99個miRNA呈上升趨勢
　　4)基于生物信息學分析對差異表達的miRNA靶基因進行GO聚類分析，顯示這些其功能涉及RNA合成、代謝及轉錄、細胞發(fā)育、細胞遷移等相關的生物過程。KE

7、GG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達的miRNA對應的靶基因主要參與了藥物代謝、GnRH、Hedgehog等信號通路;
　　5)利用String平臺進行的靶基因蛋白質互作網絡構建，并通過Cytospace軟件對互作網絡進行拓撲結構分析，篩選出在療效相關的miRNA調控網絡中作為重要節(jié)點的CALM2、CREB1等基因以及化療前后差異變化的miRNA所調控的節(jié)點基因KRAS、PTEN等;
　　6)參考TCGA數(shù)據庫中乳腺癌患者轉錄組與RN

8、A測序的信息，進一步篩選與差異表達的miRNA與相關性高的靶基因，其功能聚類提示仍以大分子代謝、發(fā)育及形態(tài)發(fā)生為主，而互作網絡分析則篩選出PPP2CA、IGF1等節(jié)點基因;
　　7)探索差異表達的miRNA及節(jié)點基因TCGA數(shù)據庫中LuminalA型乳腺癌樣本的表達水平，miR184、miR144及KITLG在不同分期病人中的表達水平具有差異性。
　　結論：1)試劑盒沉降外泌體并繼而使用試劑盒提取總RNA，在血樣保存時間較長

9、，總量較少的情況下仍能獲得相對較高的得率;
　　2)二代測序篩選出22個在PR及SD的病人樣本間差異表達的miRNA，其中2個在Kaplan Meire blot數(shù)據庫中與總生存期相關，2個在TCGA中得到驗證;針對5位PR病人化療前及化療中差異表達的miRNA共發(fā)現(xiàn)2個miRNA呈下降趨勢，60個miRNA呈上升趨勢;
　　3)差異表達的miRNA其靶基因主要與參與大分子合成代謝、細胞發(fā)育相關，并參與藥物代謝、GnRH等信