新型二聚化融合蛋白的設(shè)計與活性研究.pdf

1、目的：抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)作為實現(xiàn)腫瘤靶向治療的重要方式，近年來得到了長足的發(fā)展。這一概念的提出最初是來源于研究者期望將抗體作為化療藥物的運輸載體，減少臨床使用的化療藥物因低靶向性導(dǎo)致的毒副作用。經(jīng)歷多年的研究，Kadcyla與Adcetris在臨床上成功的運用證明了這一概念的可行性。一個合理的ADCs設(shè)計有三點需要考慮:抗體部分、效應(yīng)分子、偶聯(lián)方式。這其中抗體部分的高度靶向性是ADCs發(fā)揮作用的根本。片段抗體具有穿透性強、表達成

2、本低等優(yōu)勢，但是存在靶向性低于全抗、清除率過高的缺點，限制了其實際中在臨床上的運用。為了進一步提高片段抗體的靶向性，實現(xiàn)片段抗體運用于ADCs的構(gòu)建，本實驗基于實驗室以往的實驗成果上，在原有片段抗體anti-CD19(Fab)、融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDP中，引入一段來自人源IgG1重鏈Fc段的CH3區(qū)域，期望通過CH3區(qū)域使得單體形式的融合蛋白通過彼此CH3區(qū)域之間的分子間相互作用力形成二聚化的融合蛋白，從而提高片段抗

3、體與靶抗原的結(jié)合活性。運用Discovery Studio分子模擬軟件分析由不同長度柔性肽(G4S)連接的融合蛋白的空間構(gòu)象，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建并表達針對于CD19靶點的不同長度柔性肽連接的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3，并初步研究二聚化融合蛋白與靶細胞的結(jié)合活性。
　　方法：通過Discovery Studio分子模擬軟件的同源建模板塊模擬蛋白anti-CD19(Fa

4、b)、anti-CD19(Fab)-LDP分別與CH3通過不同長度G4S連接形成的融合蛋白的空間構(gòu)象。運用PCR、overlapPCR、酶切、連接等方法，構(gòu)建含有不同長度G4S的基因重組質(zhì)粒pAZY-anti-CD19(Fab)-CH3與pAZY-anti-CD19(Fab)-LDP-CH3，經(jīng)測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌16C9進行表達，表達產(chǎn)物經(jīng)ProteinG親和層析柱純化后，通過12％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS

5、-PAGE)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)分析鑒定。采用流式細胞檢測技術(shù)(FACS)檢測融合蛋白與CD19+B系淋巴瘤細胞系Raji的結(jié)合活性、與親代鼠源性抗體HIT19a競爭結(jié)合Raji細胞的活性;并運用高效液相分子排阻色譜法(HPLC-SEC)分析融合蛋白二聚體的比例。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建并表達了通過不同長度G4S連接的的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)和anti-CD19(Fab)

6、-LDP-CH3(A*)(B*)(C*)，融合蛋白經(jīng)Protein G親和層析柱純化后在SDS-PAGE電泳以及Western blot上表現(xiàn)為單體形式，單體相對分子質(zhì)量與預(yù)期一致。間接免疫熒光實驗結(jié)果表明，通過不同長度G4S連接的融合蛋白彼此之間在與Raji細胞的結(jié)合能力方面沒有明顯的差異。但是與以單體形式存在的anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP相比較，對應(yīng)的二聚化的融合蛋白與Raji細胞的結(jié)合能力明顯

7、提高。此外競爭性結(jié)合實驗表明，相比單體形式的anti-CD19(Fab)或者anti-CD19(Fab)-LDP，二聚化的融合蛋白與親代鼠源性抗體HIT19a競爭結(jié)合Raji細胞的能力明顯提高。
　　結(jié)論：成功通過基因工程技術(shù)構(gòu)建并通過原核系統(tǒng)表達了不同長度G4S連接的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3(A*)(B*)(C*)。體外實驗證明，不同長度G4S連