新型二聚化融合蛋白的設(shè)計(jì)與活性研究.pdf

1、目的：抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)作為實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療的重要方式，近年來得到了長足的發(fā)展。這一概念的提出最初是來源于研究者期望將抗體作為化療藥物的運(yùn)輸載體，減少臨床使用的化療藥物因低靶向性導(dǎo)致的毒副作用。經(jīng)歷多年的研究，Kadcyla與Adcetris在臨床上成功的運(yùn)用證明了這一概念的可行性。一個(gè)合理的ADCs設(shè)計(jì)有三點(diǎn)需要考慮:抗體部分、效應(yīng)分子、偶聯(lián)方式。這其中抗體部分的高度靶向性是ADCs發(fā)揮作用的根本。片段抗體具有穿透性強(qiáng)、表達(dá)成

2、本低等優(yōu)勢，但是存在靶向性低于全抗、清除率過高的缺點(diǎn)，限制了其實(shí)際中在臨床上的運(yùn)用。為了進(jìn)一步提高片段抗體的靶向性，實(shí)現(xiàn)片段抗體運(yùn)用于ADCs的構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室以往的實(shí)驗(yàn)成果上，在原有片段抗體anti-CD19(Fab)、融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDP中，引入一段來自人源IgG1重鏈Fc段的CH3區(qū)域，期望通過CH3區(qū)域使得單體形式的融合蛋白通過彼此CH3區(qū)域之間的分子間相互作用力形成二聚化的融合蛋白，從而提高片段抗

3、體與靶抗原的結(jié)合活性。運(yùn)用Discovery Studio分子模擬軟件分析由不同長度柔性肽(G4S)連接的融合蛋白的空間構(gòu)象，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建并表達(dá)針對于CD19靶點(diǎn)的不同長度柔性肽連接的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3，并初步研究二聚化融合蛋白與靶細(xì)胞的結(jié)合活性。
　　方法：通過Discovery Studio分子模擬軟件的同源建模板塊模擬蛋白anti-CD19(Fa

4、b)、anti-CD19(Fab)-LDP分別與CH3通過不同長度G4S連接形成的融合蛋白的空間構(gòu)象。運(yùn)用PCR、overlapPCR、酶切、連接等方法，構(gòu)建含有不同長度G4S的基因重組質(zhì)粒pAZY-anti-CD19(Fab)-CH3與pAZY-anti-CD19(Fab)-LDP-CH3，經(jīng)測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌16C9進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ProteinG親和層析柱純化后，通過12％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS

5、-PAGE)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)分析鑒定。采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)(FACS)檢測融合蛋白與CD19+B系淋巴瘤細(xì)胞系Raji的結(jié)合活性、與親代鼠源性抗體HIT19a競爭結(jié)合Raji細(xì)胞的活性;并運(yùn)用高效液相分子排阻色譜法(HPLC-SEC)分析融合蛋白二聚體的比例。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建并表達(dá)了通過不同長度G4S連接的的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)和anti-CD19(Fab)

6、-LDP-CH3(A*)(B*)(C*)，融合蛋白經(jīng)Protein G親和層析柱純化后在SDS-PAGE電泳以及Western blot上表現(xiàn)為單體形式，單體相對分子質(zhì)量與預(yù)期一致。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過不同長度G4S連接的融合蛋白彼此之間在與Raji細(xì)胞的結(jié)合能力方面沒有明顯的差異。但是與以單體形式存在的anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP相比較，對應(yīng)的二聚化的融合蛋白與Raji細(xì)胞的結(jié)合能力明顯

7、提高。此外競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，相比單體形式的anti-CD19(Fab)或者anti-CD19(Fab)-LDP，二聚化的融合蛋白與親代鼠源性抗體HIT19a競爭結(jié)合Raji細(xì)胞的能力明顯提高。
　　結(jié)論：成功通過基因工程技術(shù)構(gòu)建并通過原核系統(tǒng)表達(dá)了不同長度G4S連接的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3(A*)(B*)(C*)。體外實(shí)驗(yàn)證明，不同長度G4S連