布美他尼對(duì)大鼠腦缺血后軸突再生及功能恢復(fù)影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:目前腦梗死的治療仍然是臨床上的難點(diǎn)，并且治療方法有限。對(duì)于大多數(shù)腦梗死患者而言，神經(jīng)功能缺失是不可避免的。腦損傷能夠促進(jìn)大腦不同程度的神經(jīng)功能自我修復(fù)，這些修復(fù)機(jī)制包括神經(jīng)軸突和樹突結(jié)構(gòu)的重組，神經(jīng)興奮性的改變，神經(jīng)發(fā)生和血管再生。GABA是成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，正常生理?xiàng)l件下，Na+-K+-2Cl-共同轉(zhuǎn)運(yùn)體1(NKCC1)介導(dǎo)氯離子內(nèi)流，K+-Cl-共同轉(zhuǎn)運(yùn)體2(KCC2)介導(dǎo)氯離子外流。更重要的是，局灶性腦缺

2、血后，NKCC1表達(dá)上調(diào)而KCC2表達(dá)下調(diào)，因此，腦缺血后神經(jīng)氯離子穩(wěn)態(tài)的破壞最終導(dǎo)致GABAA介導(dǎo)去極化效應(yīng)。并且有證據(jù)表明，GABAA介導(dǎo)的去極化效應(yīng)可能通過(guò)激活Rho/Rock信號(hào)通路最終導(dǎo)致軸突抑制和生長(zhǎng)錐的塌陷。袢利尿劑布美他尼，是NKCC1的特異性拮抗劑，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在腦梗死急性期，布美他尼能夠抑制腦水腫，減輕神經(jīng)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。新近的研究還發(fā)現(xiàn)，在離體缺血的條件下，阻斷NKCC1上游的WNK

3、3-SPAK/OSR1調(diào)控信號(hào)的活性后，腦內(nèi)NKCC1的表達(dá)降低，同時(shí)也減少了少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的死亡。另外，有文獻(xiàn)證實(shí)布美他尼能夠逆轉(zhuǎn)軸突離斷后神經(jīng)元細(xì)胞膜GABAA介導(dǎo)的去極化效應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)和挽救受損的神經(jīng)元。然而，在腦梗死的恢復(fù)期，通過(guò)重建并維持細(xì)胞膜的氯離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而可能逆轉(zhuǎn)GABAA介導(dǎo)的去極化效應(yīng)，這能否會(huì)影響腦缺血后軸突再生并促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，目前尚不得而知。因此，本研究的目的是探討布美他尼對(duì)大鼠腦缺血后軸突再生及神經(jīng)功能

4、恢復(fù)的影響以及相關(guān)的作用機(jī)制。
　　研究方法:本研究采用雄性Wistar大鼠，體重200-250g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，將大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組（SHAM組），假手術(shù)+布美他尼組（SHAM+BUM組），缺血組（ISC組），缺血+布美他尼組（ISC+BUM組）。根據(jù)大鼠腦解剖圖譜，用立體定位的方法將內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)注射到大鼠大腦皮質(zhì)的運(yùn)動(dòng)區(qū)及紋狀體區(qū)而形成局部腦缺血的方法來(lái)制作大鼠腦缺血模

5、型。腦缺血14天后，同樣使用立體定位的方法向大鼠腦內(nèi)運(yùn)動(dòng)皮層注射生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine，BDA)對(duì)皮質(zhì)脊髓束進(jìn)行順行示蹤標(biāo)記。于腦缺血術(shù)后第7天開始，用立體定位的方法在大鼠側(cè)腦室埋置微量注藥系統(tǒng)持續(xù)給予布美他尼21天注射治療。于腦缺血術(shù)后第30-32天應(yīng)用梯形平衡木行走實(shí)驗(yàn)，圓筒試驗(yàn)以及粘性標(biāo)簽測(cè)試對(duì)大鼠患側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。以上各組大鼠分別在腦缺血術(shù)后第33天用4％多聚甲醛灌注固

6、定，取大鼠腦組織及頸段脊髓組織，用恒冷冰凍切片機(jī)進(jìn)行大腦冰凍切片(片厚30μm)和脊髓切片(片厚50μm和30μm)的制備。應(yīng)用尼氏染色方法測(cè)量缺血組、缺血+布美他尼組之間大腦梗死體積的差異。應(yīng)用免疫熒光法觀測(cè)BDA示蹤標(biāo)記的起源于健側(cè)皮層的皮質(zhì)脊髓束陽(yáng)性纖維越過(guò)脊髓中線支配失神經(jīng)支配脊髓灰質(zhì)的延伸情況及相應(yīng)的vGlut1（突觸前標(biāo)記物）和PSD-95（突觸后標(biāo)記物）的表達(dá)情況。并且進(jìn)行BDA/vGlut1及BDA/PSD-95的雙重標(biāo)

7、記染色。同樣用免疫熒光法觀測(cè)腦缺血后側(cè)腦室持續(xù)給予布美他尼21天注射治療后對(duì)梗死側(cè)大腦皮層周邊的NKCC1與Nogo-A表達(dá)情況的影響。在共聚焦顯微鏡下獲取大鼠脊髓BDA陽(yáng)性纖維的Z軸方向連續(xù)圖層后，對(duì)軸突纖維進(jìn)行三維重建，然后使用NIH ImageJ軟件對(duì)芽生軸突進(jìn)行追蹤描繪和測(cè)量，以觀測(cè)BDA標(biāo)記的皮質(zhì)脊髓束纖維的芽生情況。腦缺血術(shù)后第33天，使用Western blot法檢測(cè)大鼠梗死皮層周邊的NKCC1，KCC2及BDNF的表達(dá)水

8、平情況。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0 for windows進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)來(lái)判斷差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:1、腦梗死體積的測(cè)量。ISC組、ISC+BUM組之間梗死體積沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。2、布美他尼對(duì)大鼠腦缺血后皮質(zhì)脊髓束軸突再生的影響。缺血(ISC)組BDA示蹤標(biāo)記的陽(yáng)性纖維通過(guò)脊髓灰質(zhì)聯(lián)合跨過(guò)中線的芽生軸突側(cè)枝的總長(zhǎng)度較假

9、手術(shù)組（SHAM組）及SHAM+BUM組相比明顯增加（P＜0.01）。而ISC+BUM組的BDA陽(yáng)性纖維通過(guò)脊髓灰質(zhì)聯(lián)合跨過(guò)中線的芽生軸突側(cè)枝的總長(zhǎng)度與缺血組比較又進(jìn)一步增加(P＜0.01)。3、布美他尼對(duì)大鼠腦缺血后新芽生軸突突觸重塑的影響。缺血組失神經(jīng)支配側(cè)脊髓前角的突觸標(biāo)記物PSD-95、vGlut1的表達(dá)水平較假手術(shù)組及SHAM+BUM組明顯減少(P＜0.01)。而ISC+BUM組失神經(jīng)支配側(cè)脊髓的突觸標(biāo)記物PSD-95、vGl

10、ut1的表達(dá)水平較缺血組明顯增多(P＜0.01)。并且BDA標(biāo)記的陽(yáng)性纖維還可以與PSD-95、vGlut1形成共定位雙標(biāo)染色。4、布美他尼能夠下調(diào)腦缺血后梗死皮層周邊NKCC1的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)KCC2的表達(dá)水平。缺血組梗死側(cè)皮層周邊NKCC1蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組及SHAM+BUM組明顯增多(P＜0.01)，而布美他尼（ISC+BUM組）能夠逆轉(zhuǎn)腦缺血后NKCC1的這種提高(P＜0.05)。腦缺血后，梗死皮層周邊KCC2蛋白的表達(dá)較

11、假手術(shù)組及SHAM+BUM組明顯減少(P＜0.01)，而布美他尼（ISC+BUM組）能夠逆轉(zhuǎn)腦缺血后KCC2的這種降低(P＜0.05)。5、布美他尼能夠下調(diào)大鼠腦缺血后梗死皮層周邊NogoA的表達(dá)水平。缺血組梗死皮層周邊NogoA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組及SHAM+BUM組明顯增多(P＜0.01)，而布美他尼（ISC+BUM組）能夠逆轉(zhuǎn)腦缺血后NogoA的這種提高(P＜0.01)。6、布美他尼能夠上調(diào)大鼠腦缺血后梗死皮層周邊BDNF蛋白的表

12、達(dá)水平。缺血組梗死皮層BDNF蛋白的表達(dá)較SHAM+BUM組明顯增多（P＜0.01），而ISC+BUM組梗死皮層BDNF蛋白的表達(dá)比缺血組進(jìn)一步增加(P＜0.01)。7、布美他尼能夠促進(jìn)腦缺血后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。在平衡木實(shí)驗(yàn)中，腦缺血大鼠平衡木的錯(cuò)誤百分率明顯高于假手術(shù)組及SHAM+BUM組(P＜0.01)，而ISC+BUM組大鼠平衡木的錯(cuò)誤百分率明顯低于缺血組（P＜0.05）;在圓筒實(shí)驗(yàn)中，缺血組大鼠患側(cè)肢體的觸壁率明顯低于假手術(shù)組

13、及SHAM+BUM組(P＜0.01)，而布美他尼能夠逆轉(zhuǎn)大鼠腦缺血后患側(cè)肢體的使用率的降低(P＜0.05)。在粘性標(biāo)簽測(cè)試中，缺血組大鼠與對(duì)照組比較第一次觸碰患側(cè)肢體粘性標(biāo)簽的時(shí)間以及除掉粘性標(biāo)簽的時(shí)間明顯增加(P＜0.01)，而布美他尼能夠降低腦缺血大鼠第一次觸碰患側(cè)肢體粘性標(biāo)簽以及除掉粘性標(biāo)簽所需要的時(shí)間(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、布美他尼促進(jìn)了大鼠腦缺血后皮質(zhì)脊髓束軸突的再生以及新生軸突的突觸重塑。2、腦缺血后布美他尼