縫隙連接蛋白43類(lèi)似物(Gap26)對(duì)新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 Gap26對(duì)新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護(hù)作用
　　目的：1、觀察新生大鼠缺血缺氧損傷后縫隙連接蛋白43(Cx43)1周內(nèi)的含量變化；
　　2、觀察Gap26對(duì)新生大鼠腦缺血缺氧損傷是否具有保護(hù)作用。
　　方法：出生7天的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、假手術(shù)+Gap26（Sham+Gap26）組、缺血缺氧（HI）組和缺血缺氧+Gap26（HI+Gap26）組，建立新生大鼠缺血缺氧(the hypoxia

2、/ischemia model，HI)模型，取缺血損傷側(cè)腦組織為標(biāo)本，采用Western blot法測(cè)定缺血缺氧1周內(nèi)Cx43蛋白的表達(dá)；觀察缺氧前1小時(shí)給予Gap26(不同給藥劑量)處理對(duì)新生大鼠腦梗死體積的影響以及缺血缺氧后連續(xù)給藥1周對(duì)新生大鼠遠(yuǎn)期神經(jīng)行為功能的影響。
　　結(jié)果：1、Cx43在缺血缺氧4小時(shí)后開(kāi)始增加，在8小時(shí)后明顯增加，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加；在缺血缺氧后1周，Cx43含量相對(duì)于假手術(shù)組增加了18倍左右。

3、
　　2、與手術(shù)組相比，經(jīng)Gap26處理后大鼠的腦梗死體積明顯減小，神經(jīng)行為功能明顯增強(qiáng)。缺氧前1小時(shí)腹腔預(yù)給予Gap2625μg/kg，48小時(shí)后腦梗塞體積減小了24.56％；且該神經(jīng)保護(hù)作用具有劑量依賴性。另一Cx43類(lèi)似物Gap27（25μg/kg）預(yù)處理，相對(duì)于手術(shù)組同樣減少腦梗塞體積26.21%左右。缺血缺氧后連續(xù)給藥1周，分別于第2、3、4周進(jìn)行前爪抓握實(shí)驗(yàn)和足錯(cuò)誤實(shí)驗(yàn)，第4周進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，給藥組大鼠的抓握能力、平衡

4、能力以及學(xué)習(xí)記憶功能明顯優(yōu)于手術(shù)組，各項(xiàng)神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；4周后給藥組大鼠的半腦損失量明顯低于手術(shù)組（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、新生大鼠缺血缺氧后，腦組織Cx43含量明顯增加，并且存在時(shí)間依賴性。說(shuō)明Cx43蛋白含量在新生大鼠缺血缺氧早期（24小時(shí)）及晚期（24小時(shí)后）的病理生理學(xué)變化中均起到重要的作用。
　　2、使用Gap26干預(yù)新生大鼠HI模型，大鼠的腦梗死體積明顯減小，遠(yuǎn)期神經(jīng)行為

5、功能缺損明顯減輕。這些均提示Gap26對(duì)新生大鼠腦缺血缺氧損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分 Gap26對(duì)新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護(hù)機(jī)制
　　目的：1、觀察Gap26對(duì)新生大鼠缺血缺氧損傷后腦組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)、細(xì)胞外谷氨酸含量、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)的影響；
　　2、研究Gap26對(duì)新生大鼠及元代星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷后Cx43的過(guò)量表達(dá)的影響以及兩者相互作用的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：

6、1、將出生7天的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、假手術(shù)+Gap26（Sham+Gap26）組、缺血缺氧（HI）組和缺血缺氧+Gap26（HI+Gap26）組，建立HI模型，取缺血損傷側(cè)腦組織為標(biāo)本：采用Western blot法檢測(cè)Cx43、GFAP、Cleaved Caspase-3的表達(dá)；采用微透析方法提取新生大鼠活體腦組織細(xì)胞外液，利用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定腦組織及其細(xì)胞外透析液中谷氨酸的含量；采用免疫共沉淀法檢測(cè)腦

7、組織勻漿中的Cx43與生物素（biotin）標(biāo)記的Gap26有無(wú)相互作用關(guān)系；采用免疫熒光染色法觀察各實(shí)驗(yàn)組腦組織冰凍切片星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、Cx43的表達(dá)以及biotin-Gap26與Cx43定位關(guān)系。
　　2、將出生2天的SD大鼠取元代星形膠質(zhì)細(xì)胞種板，隨機(jī)分為對(duì)照(Con)組、對(duì)照+Gap26（Con+Gap26）組、氧糖剝奪（OGD）組和氧糖剝奪+Gap26（OGD+Gap26）組，制作細(xì)胞氧糖剝奪（OGD）模型，觀察缺氧

8、前給予Gap26處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷的影響：通過(guò)Westwen blot法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷后各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)不同處理方法下Cx43、Akt、p-Akt的表達(dá)水平；利用交聯(lián)劑BS3標(biāo)記細(xì)胞膜表面蛋白；采用免疫熒光染色法觀察細(xì)胞爬片上星形膠質(zhì)細(xì)胞biotin-Gap26與Cx43定位關(guān)系；采用MTT方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力；采用免疫共沉淀法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組泛素化Cx43的含量。
　　結(jié)果：1、Gap26明顯降低腦缺

9、血損傷后Cx43、GFAP和Cleaved Caspase-3的過(guò)量表達(dá)（P<0.05），減少缺血損傷側(cè)腦組織及其細(xì)胞外液谷氨酸的含量（P<0.05）；熒光染色顯示Gap26抑制HI組星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活以及Cx43的過(guò)量表達(dá)，Cx43與biotin-Gap26在腦組織有共定位關(guān)系；免疫共沉淀法檢測(cè)腦組織勻漿中的Cx43與biotin-Gap26有相互作用關(guān)系，而作為對(duì)照組的biotin-P5則與Cx43沒(méi)有相關(guān)性。
　　2、Cx

10、43與biotin-Gap26在星形膠質(zhì)細(xì)胞存在共定位關(guān)系；Gap26/Gap27明顯降低Cx43的表達(dá)（P<0.05），同樣可以減少小分子Cx43在OGD損傷后的過(guò)量表達(dá)，但對(duì)細(xì)胞膜表面和胞漿的Cx43具有不同的作用；Gap26顯著升高OGD損傷后p-Akt的表達(dá)以及泛素化Cx43的含量（P<0.05），PI3K特異性抑制劑LY294002、蛋白酶體抑制劑MG132以及溶酶體抑制劑氯喹均能在不同程度上抑制Cx43的降解以及PI3K/A

11、kt通路的激活，降低Gap26對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，以LY294002、MG132作用為著（P<0.05）；免疫共沉淀結(jié)果顯示LY294002部分抑制了Cx43的泛素化水平。
　　結(jié)論：
　　1、Gap26對(duì)新生大鼠缺血缺氧損傷的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制與抑制細(xì)胞外毒性水平的谷氨酸的釋放、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　2、Gap26主要通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解缺血缺氧損傷后過(guò)度表達(dá)的Cx43，這種作用依賴