新型α-MSH類似物對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用的機(jī)制探討.pdf

1、Alpha-黑素細(xì)胞刺激素(alpha-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是由其前體——阿黑皮素原(proopiomelanoeortin)裂解產(chǎn)生,其通過(guò)與黑皮素受體(melanocortin receptor,MCR)結(jié)合而發(fā)揮作用。α-MSH具有很強(qiáng)的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用。α-MSH具有獨(dú)特的抗炎特點(diǎn)：它可直接作用于腦細(xì)胞,抑制腦局部促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,保護(hù)神經(jīng)元功能；通過(guò)下行神經(jīng)通路抑制細(xì)

2、菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的外周循環(huán)中促炎癥細(xì)胞因子生成；又可直接作用于外周組織細(xì)胞,抑制促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生及活性。α-MSH抑制多種類型的人體細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他的炎癥介質(zhì),包括NO和前列腺素等。α-MSH不是完全消除炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,而是適度地抑制其生成量,可以減輕炎癥反應(yīng)程度但卻不損害宿主的防御能力。α-MSH的抗炎作用在某種程度上是通過(guò)抑制核因子NF-κB完成的。但是α-MSH作為抗炎免疫調(diào)節(jié)劑,本身也存在缺點(diǎn),其對(duì)MC1-R和MC3-R有

3、較高的選擇性,對(duì)MC4-R和MC5-R的親和力很低。我室研制的新型α-MSH類似物顯示出對(duì)MCl-R和MC5-R的選擇性,能減少一定的副作用。 急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種常見(jiàn)危重癥,病死率極高,嚴(yán)重威脅重癥患者的生命并影響其生存質(zhì)量。ALI/ARDS是在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾

4、病過(guò)程中,肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。以肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、嚴(yán)重的通氣/血流比例失調(diào)為病理生理特征,臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫,肺部影像學(xué)上表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變。流行病學(xué)調(diào)查顯示ALI/ARDS是臨床常見(jiàn)危重癥。 盡管ARDS已經(jīng)研究了近40年,臨床重癥監(jiān)護(hù)在期間取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。然而ARDS的死亡率仍高達(dá)40％～60％。人們對(duì)于ALI

5、/ARDS發(fā)病機(jī)理的研究從未間斷,當(dāng)務(wù)之急是建立趨于完善的模擬臨床的動(dòng)物模型。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)不同原因所致ALI/ARDS的發(fā)病原理及病理過(guò)程可能會(huì)有很大的不同,因而對(duì)ALI/ARDS致病動(dòng)物模型的選用至關(guān)重要。目前認(rèn)為“兩次打擊理論”更能反映體內(nèi)的實(shí)際發(fā)病情況。此理論認(rèn)為嚴(yán)重多發(fā)骨折等創(chuàng)傷作為第1次打擊使機(jī)體處于中等狀態(tài)的全身炎癥反應(yīng)綜合征,此時(shí)如果遭受感染因素或不恰當(dāng)復(fù)蘇、手術(shù)打擊、再次致傷因素等第二次打擊,放大了已存在的炎癥狀態(tài)

6、而發(fā)生過(guò)度的全身炎癥反應(yīng)綜合征,會(huì)繼發(fā)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征以及多器官功能障礙綜合征。失血性休克與內(nèi)毒素血癥都是臨床多發(fā)病,特別是對(duì)于戰(zhàn)傷,更具有重要的實(shí)際意義。因此,本研究選擇了先失血性休克,1 h后再氣道內(nèi)直接滴入LPS的方式來(lái)建立大鼠ALI模型,這樣可以造成直接的肺損傷為主的ALl模型。近年來(lái),許多研究人員對(duì)α-MSH在各種臟器炎癥中的作用進(jìn)行了大量的研究并給予了充分的肯定。但是,新型α-MSH類似物在ALI/ARDS中是

7、否有保護(hù)作用仍未可知。 因此,本課題采用大鼠的二次打擊ALI模型研究我室的新型α-MSH類似物對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用,并試圖探討一些新的作用機(jī)制,同時(shí)以α-MSH作為對(duì)照。首先是建立大鼠失血性休克+LPS二次打擊模型,即采用自制的裝置從大鼠頸動(dòng)脈放血,在15 min內(nèi)使血壓降至40 mmHg,并維持此血壓1 h。之后,在2 h內(nèi)將全部失血回輸至體內(nèi),并補(bǔ)充適當(dāng)?shù)纳睇}水以恢復(fù)到最初的壓力水平。休息1 h后,再?gòu)臍夤軆?nèi)滴入LP

8、S進(jìn)行二次打擊,完成ALI模型的制作并維持6 h。另有動(dòng)物除了給予LPS外,還同時(shí)給予α-MSH或α-MSH類似物,觀察其保護(hù)作用。這樣可將動(dòng)物分為四組,即假手術(shù)(sham)組,LPS組以及LPS+α-MSH組和LPS+α-MSH類似物組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用放血法處死大鼠,分別收集血漿、肺泡灌洗液(BALF)及肺組織待檢。 本實(shí)驗(yàn)采用HE染色觀察了各組肺組織的病理改變情況；采用ELISA分別檢測(cè)了BALF中的TNF-α、IL-1β

9、、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)及IL-10的濃度；采用化學(xué)法測(cè)定了BALF和肺組織中LDH、MDA、MPO、總蛋白含量和SOD的活性；采用免疫組化(Immunohistochemistry)方法觀察了肺組織的P-選擇素(P-selectin)的表達(dá)情況；用Western Blot檢測(cè)了肺組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)水平變化：以Real-time PCR方法檢測(cè)了纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞化學(xué)

10、趨化因子-1(CINC-1)、Clara細(xì)胞蛋白(CC16)、血紅素加氧酶-l(HO-1)等的表達(dá)。結(jié)果顯示：與sham組比較,LPS組肺組織損傷嚴(yán)重,出現(xiàn)肺泡壁增厚,炎細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有輕度水腫等病理改變,α-MSH類似物和α-MSH能明顯改善這種情況。BALF中TNF-α、IL-1β、MIF、總蛋白含量和LDH代表了肺內(nèi)炎癥狀況,前三者為促炎因子,LDH與總蛋白含量相互配合常用來(lái)表示肺組織的損傷程度。MDA和SOD反應(yīng)了肺內(nèi)的氧化應(yīng)激水

11、平。肺組織中MPO是用來(lái)反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的一個(gè)比較靈敏的指標(biāo)。在二次打擊后,這幾項(xiàng)指標(biāo)顯著增高(P<0.05),而抗炎因子IL-10則無(wú)明顯降低(P>0.05),由于其作用的復(fù)雜性,其在ALI中的作用還有待于進(jìn)一步研究。P-選擇素在中性粒細(xì)胞黏附血管壁的過(guò)程中起著很重要的作用,免疫組化結(jié)果表明,在給予LPS后,P-選擇素表達(dá)量增加,同時(shí)給予α-MSH類似物或α-MSH則能抑制其表達(dá)。大量研究證實(shí),纖溶系統(tǒng)參與了ALI的發(fā)生過(guò)程,其中P

12、Al-1最為關(guān)鍵。ALI的一個(gè)顯著特征就是大量的中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)被扣押,而CINC-1是大鼠體內(nèi)最重要的中性粒細(xì)胞趨化因子,類似于人體內(nèi)的IL-8。HO-1和CC16是兩個(gè)肺內(nèi)有著重要作用的抗炎因子。Real-time PCR結(jié)果顯示,二次打擊后肺組織內(nèi)PAI-1、CINC-1和HO-1 mRNA水平顯著上調(diào),CC16則下調(diào),α-MSH類似物和α-MSH均能抑制前三者的上調(diào)和抑制CC16的下調(diào)(P<0.05)。 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)在

13、于：①研究了我室自主設(shè)計(jì)的新型α-MSH類似物對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用,各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：α-MSH類似物與α-MSH都能有效地抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、粘附分子P-選擇素、趨化因子CINC-1以及纖溶系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子PAl-1上調(diào),以及能顯著地促進(jìn)抗炎因子HO-1的活性,顯示了其抗炎特性。②對(duì)α-MSH這種神經(jīng)內(nèi)分泌肽調(diào)節(jié)炎癥的作用機(jī)制有新的探討,揭示出α-MSH在趨化因子,粘附分子及纖溶系統(tǒng)方面以前不為人所知的抗炎機(jī)制。AL

14、I中最關(guān)鍵的因素是中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),而P-選擇素在中性粒細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中起著重要的作用,介導(dǎo)了中性粒細(xì)胞于肺微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的起始粘附,而α-MSH類似物能有效地抑制這一過(guò)程。PAI-1是體內(nèi)纖溶系統(tǒng)中最重要的抑制物,對(duì)于穩(wěn)定體內(nèi)正常的血流起著很重要的作用。肺纖溶活性異常是急性和慢性炎癥性肺損傷的共同表現(xiàn)。α-MSH能夠有效地抑制PAI-1的上調(diào),促進(jìn)血液循環(huán)正?；?緩解肺部炎癥。CINC-1是大鼠體內(nèi)最重要的中性粒細(xì)胞趨化因子,

15、而α-MSH也能有效地阻止其上調(diào),這對(duì)于抑制中性粒細(xì)胞向肺部遷徙和穿越起著不可估量的作用。本課題還研究了與肺部關(guān)系密切的兩個(gè)抗炎因子:HO-1和CC16。α-MSH可以促進(jìn)CC16的上調(diào)和HO-1的下調(diào),這對(duì)于判定ALI的病情也具有一定的幫助。③本研究還改進(jìn)了動(dòng)物模型的制作。以往的2次打擊模型,死亡率高,穩(wěn)定性和重復(fù)性很難令人滿意,加之動(dòng)物個(gè)體之間有很大的差異,用這樣的模型很難得出令人信服的結(jié)論。本研究采用自動(dòng)調(diào)整血壓的裝置代替注射器抽