miR-31靶向抑制FIH并調(diào)控其下游HIF1α-TIMP1-MMP1通路促進(jìn)增生性瘢痕形成.pdf

1、目的：
　　創(chuàng)傷后的瘢痕增生，是由于細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積或者降解減少而產(chǎn)生，給患者帶來疼痛，瘙癢，畸形和甚至毀容等問題。但其產(chǎn)生的生物學(xué)調(diào)控機制仍然不詳，目前臨床上并沒有較有效的治療手段。MicroRNA（微小 RNA）是一種可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小分子 RNA，在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)HS（Hypertrophic scar增生性疤痕）組織中miR-31(MicroRNA-31)表達(dá)量最高，它的出現(xiàn)可能會給我們提

2、供新的思路和治療靶點。HIF1α(hypoxia inhibit factor1α缺氧誘導(dǎo)因子1α)在近年來的研究中被發(fā)現(xiàn)對疤痕的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，但具體機制仍不清楚。本文我們將探索miR-31與HIF1α是如何促進(jìn)疤痕的增生，二者間是否存在影響，并通過裸鼠體內(nèi)試驗來驗證miR-31作用的有效性。本實驗深入的研究了miR-31在增生性瘢痕形成中的作用及生物學(xué)機制，并為增生性疤痕的預(yù)防和臨床治療提供了理論依據(jù)和新的切入點。
　　方法：

3、
　　1、正常皮膚真皮組織及增生性瘢痕真皮組織的樣本采集；福爾馬林溶液浸泡后用石蠟進(jìn)行包埋固定，切片給予HE染色、Masson染色和免疫組化染色；RT-PCR檢測正常皮膚真皮組織和增生性瘢痕組織中miR-31的相對表達(dá)差異；WB(western blot)檢測NS(Normal skin正常皮膚組織)與HS組織中HIF1α的蛋白表達(dá)差異。
　　2、進(jìn)行人NSFBs(Normal skin fibroblasts正常皮膚成纖維

4、細(xì)胞)和HSFBs(Hypertrophic scar fibroblats增生性疤痕成纖維細(xì)胞)的培養(yǎng)，RT-PCR對不同代次細(xì)胞檢測其miR-31；Fn(Fibronectin纖維鏈接蛋白);Col1a1(collage1a1膠原1 a1);Col3a1(collage3a1膠原3 a1)；TGF-β(Transforming growth factor beta轉(zhuǎn)化生長因子-β)的表達(dá)量，驗證細(xì)胞模型構(gòu)建的可用性。構(gòu)建miR-31

5、過表達(dá)干擾載體,并轉(zhuǎn)染入NSFBs；反義干擾載體，并轉(zhuǎn)染入HSFBs。RT-PCR、WB檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的miR-31;Fn;Col1a1;Col3a1的表達(dá)量，從而觀察miR-31對成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　3、檢索生物信息數(shù)據(jù)庫，包括：Targetscan, miRanda，PicTar等，通過計算機運算非翻譯區(qū)的核苷酸結(jié)合度來預(yù)測miR-31的靶基因，篩選與缺氧相關(guān)的特定靶基因FIH（Factor inhibit HI

6、F缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子）。螢火素酶報告及RT-PCR、WB檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的FIH的表達(dá)量，驗證miR-31靶向抑制FIH。
　　4、RT-PCR、WB檢測細(xì)胞過表達(dá)和反義表達(dá)miR-31后，HIF1α;TIMP-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase基質(zhì)金屬蛋白抑制因子1);MMP1(matrix metalloproteinases-1基質(zhì)金屬蛋白酶-1)的表達(dá)量，從而觀察miR-31對H

7、IF1α及其下游調(diào)控蛋白的影響。
　　5、將 HSFBs培養(yǎng)于缺氧的環(huán)境中，并于24h;48h;72h三個時間節(jié)點檢測Fn;Col1a1;Col3a1；TIMP-1;MMP1的蛋白表達(dá)量，從而闡明HIF1α促進(jìn)疤痕增生的原因。
　　6、建立體外裸鼠疤痕模型，觀察miR-31抑制劑局部干預(yù)后Fn;Col1a1;Col3a1的表達(dá)量變化。
　　結(jié)果：
　　HS組織及細(xì)胞中miR-31及HIF1α表達(dá)量都顯著升高，體外

8、實檢測到Fn;Col1a1; Col3a1三個纖維化指標(biāo)的表達(dá)量與miR-31呈正相關(guān)，從而得出miR-31可以促進(jìn)HS的發(fā)生。此外HIF1α與miR-31在成纖維細(xì)胞中有類似的作用，也可以促進(jìn)纖維化指標(biāo)的表達(dá)，成纖維細(xì)胞梯度低氧實驗驗證了TIMP-1是HIF1α的下游作用基因，與HIF1α的表達(dá)正相關(guān)。MMP1已多次被驗證有促進(jìn)Fn;Col1a1;Col3a1降解的作用，而TIMP-1是MMP1的抑制因子，所以隨著缺氧的加深，纖維化指

9、標(biāo)的過度表達(dá)是通過增強TIMP-1對MMP1的抑制作用而實現(xiàn)的。FIH是缺氧誘導(dǎo)因子的抑制因子，它可以抑制HIF1α對下游基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)作用。螢火素酶報告，RT-PCR及WB實驗得出FIH是miR-31的靶基因，并且HIF1α對疤痕的這一促進(jìn)作用可以被miR-31所增強。綜上我們得出miR-31增強HIF1α-TIMP-1-MMP1通路促進(jìn)HS發(fā)生。為了進(jìn)一步驗證miR-31在HS中作用的確定性，設(shè)計動物實驗。miR-31抑制劑局部干預(yù)