穿心蓮種質(zhì)資源及其質(zhì)量評(píng)價(jià)研究.pdf

1、穿心蓮是一具有國(guó)際代表性的重要藥用植物，在中國(guó)、印度、馬來(lái)西亞等國(guó)家具有悠久的民間藥用史，用于防治上呼吸道感染、胃腸及肝膽疾病，且被廣泛、大量地應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外制藥行業(yè)。穿心蓮是廣東省特色中藥材之一，以穿心蓮為主要組成藥物的消炎利膽片即是廣東省名優(yōu)產(chǎn)品。近年來(lái)，關(guān)于穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分治療肺炎、肝炎、結(jié)腸癌、呼吸道感染、糖尿病和艾滋病等藥理研究報(bào)導(dǎo)越來(lái)越多，穿心蓮藥材在國(guó)內(nèi)外的需求量與日俱增，迫切需要優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)穩(wěn)定的藥材供應(yīng)。為保證穿心蓮藥用植物

2、資源的可持續(xù)發(fā)展和利用，有必要對(duì)目前我國(guó)穿心蓮藥用植物資源進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，并對(duì)其進(jìn)行種質(zhì)資源研究和質(zhì)量評(píng)價(jià)，探索穿心蓮優(yōu)良種質(zhì)培育途徑，完善穿心蓮種質(zhì)資源質(zhì)量評(píng)價(jià)方法;另一方面，是將傳統(tǒng)種質(zhì)資源研究方法與現(xiàn)代科學(xué)研究相結(jié)合的有益嘗試，為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)穿心蓮的培育和中藥資源的開(kāi)發(fā)利用研究提供了一些新的想法和思路。
　　主要研究?jī)?nèi)容概述如下:
　　一、穿心蓮種質(zhì)資源調(diào)查研究
　　（一）穿心蓮種質(zhì)資源分布、生物學(xué)特性及產(chǎn)銷(xiāo)情況調(diào)查<

3、br>　　對(duì)廣東、福建、廣西、四川及云南的穿心蓮種質(zhì)資源進(jìn)行了生物學(xué)特性、資源蘊(yùn)藏量及產(chǎn)銷(xiāo)情況等多方面的調(diào)查，并收集了大量樣品。在實(shí)地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)目前僅在云南文山、福建泉州有極少野生資源分布，多為單株生長(zhǎng)于人跡罕至的森林中，但由于氣候以及人為因素，已近乎滅絕，此外便是零星分布的半野生穿心蓮。目前栽培穿心蓮主要分布在廣東省湛江市和清遠(yuǎn)市、福建省漳州市、廣西省貴港市和南寧市、四川省宜賓市，穿心蓮在這四省的栽培面積分別約為5000畝、4000畝

4、、6萬(wàn)畝、2000畝，以廣西省種植面積最大，而且廣西有專(zhuān)門(mén)的種子田，四川和廣東所用穿心蓮種子均來(lái)源于廣西，而云南自2010年后已無(wú)種植。栽培穿心蓮多采用單作或套種，采收加工方法隨意，多是當(dāng)?shù)厮幧袒蛩幤笾苯邮召?gòu)穿心蓮干燥地上部分或葉、莖、根部位，收購(gòu)價(jià)2～8元。不同產(chǎn)地的穿心蓮其形態(tài)特征存在較大差別，葉片大小、花徑大小、株高等是主要的形態(tài)多樣性指標(biāo)。
　?。ǘ┐┬纳彿N質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)信息系統(tǒng)構(gòu)建
　　以“西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)”

5、和“南藥種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)”為參考，建立了穿心蓮種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)信息系統(tǒng)，在Windows環(huán)境下構(gòu)建數(shù)據(jù)管理平臺(tái)，詳細(xì)載入了穿心蓮的資源分布、蘊(yùn)藏量、生境、生物學(xué)特性，以及不同產(chǎn)地穿心蓮種質(zhì)資源原植物、標(biāo)本及其化學(xué)指紋圖譜等圖片信息，從而利于穿心蓮種質(zhì)資源信息的實(shí)時(shí)更新以及資源保護(hù)。
　　二、穿心蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性研究
　?。ㄒ唬┗?種同工酶的穿心蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性研究
　　采用過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、

6、細(xì)胞色素氧化酶、酯酶、過(guò)氧化氫酶電泳技術(shù)，對(duì)3份野生穿心蓮種質(zhì)資源和27份栽培穿心蓮的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，6種同工酶共檢測(cè)到24條穩(wěn)定酶帶，其中1條為特異酶帶，出現(xiàn)在福建省泉州野生穿心蓮多酚氧化酶酶譜中。上述6種同工酶的多肽位點(diǎn)百分率分別為75.00％、40.00％、57.14％、0.00％、33.33％和66.66％。30份穿心蓮材料間的相似系數(shù)介于0.708～1.000，平均值為0.863，遺傳距離介于0.000～0.19

7、7，平均遺傳距離為0.087，福建泉州野生穿心蓮與栽培品種間的相似系數(shù)相對(duì)較小，遺傳距離較大，其它穿心蓮種質(zhì)資源間的相似系數(shù)較大，遺傳距離較小。聚類(lèi)分析表明在相似系數(shù)為0.795處可將30份穿心蓮材料聚為3類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)由福建泉州野生穿心蓮組成;第Ⅱ類(lèi)由廣東湛江市遂溪縣栽培穿心蓮組成;剩余的23份穿心蓮材料聚為第Ⅲ類(lèi)，其在相似系數(shù)為0.848處聚為3個(gè)亞類(lèi)。主成分分析將30份穿心蓮材料分成10個(gè)彼此孤立的成分，且其分布位置較近。結(jié)果表明30

8、份不同產(chǎn)地穿心蓮種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平極低，其中福建泉州野生穿心蓮與栽培穿心蓮間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　?。ǘ┐┬纳徣~綠體基因組序列測(cè)定及主要基因片段的比較分析
　　通過(guò)雙向延伸葉綠體的兩個(gè)保守基因獲得葉綠體基因組骨架序列再對(duì)其堿基進(jìn)行校正以獲得最終序列的方法獲得穿心蓮葉綠體基因組序列，為爵床科第一條葉綠體基因組序列。穿心蓮的葉綠體基因組全長(zhǎng)150249 bp，含38.3％ GC，呈典型四段式結(jié)構(gòu)，編碼132個(gè)基因，去除

9、重復(fù)后為114個(gè)，包括80個(gè)蛋白編碼、30個(gè)tRNA和4個(gè)rRNA基因，在穿心蓮葉綠體蛋白編碼基因中matK基因的序列變異最大。在穿心蓮的葉綠體基因組中共檢測(cè)到4對(duì)正向、5對(duì)反向、7條串聯(lián)重復(fù)序列和154個(gè)SSR位點(diǎn)?；?3個(gè)物種的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)分析發(fā)現(xiàn)這些物種的SSR絕大多數(shù)為連續(xù)A或連續(xù)T，在葉綠體基因組內(nèi)呈不均一分布。比較基因組研究表明穿心蓮與其它三個(gè)唇形目物種的葉綠體基因組之間整體相似性較好，基因間區(qū)的變異最大。序列變

10、異分析發(fā)現(xiàn)了菊分支10個(gè)變異最大的基因和10個(gè)最保守的基因，其中matK是平均遺傳距離最大的基因，可以作為穿心蓮最好的遺傳標(biāo)記。經(jīng)比較，不同產(chǎn)地穿心蓮的葉綠體基因序列間沒(méi)有差別，這從葉綠體基因角度說(shuō)明不同產(chǎn)地穿心蓮種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平較低。基于73個(gè)葉綠體蛋白編碼基因的系統(tǒng)進(jìn)化研究表明穿心蓮在現(xiàn)有葉綠體基因組公布的菊分支物種中與丹參關(guān)系最近。
　　三、環(huán)境因子對(duì)穿心蓮生物學(xué)特性影響的研究
　　（一）土壤理化性質(zhì)對(duì)穿心蓮質(zhì)

11、量性狀的影響
　　對(duì)穿心蓮不同產(chǎn)地的土壤因子進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)中性偏弱酸性土壤較為適宜穿心蓮的生長(zhǎng)，而土壤質(zhì)地以紅壤為好。同時(shí)對(duì)不同產(chǎn)地間土壤中所含大量元素對(duì)穿心蓮質(zhì)量性狀的影響進(jìn)行研究，通過(guò)相關(guān)性分析和通徑分析可以看出土壤理化性質(zhì)對(duì)穿心蓮質(zhì)量性狀影響較大，土壤pH及所含的氮、磷、鉀、有機(jī)質(zhì)等與穿心蓮中所含總內(nèi)酯、總黃酮、醇溶性浸出物含量均有一定的相關(guān)性。其中速效磷是直接影響穿心蓮總內(nèi)酯含量的重要元素，提示適當(dāng)增施磷肥，可以提高穿

12、心蓮的質(zhì)量。同時(shí)由于有機(jī)質(zhì)與總黃酮也有極顯著正相關(guān)，且其對(duì)總黃酮的間接作用最大，表明在穿心蓮種植中可以通過(guò)實(shí)施有機(jī)肥影響土壤中其它成分的含量以提高穿心蓮質(zhì)量，為穿心蓮規(guī)范化種植提供了參考。
　?。ǘ┓柿蠈?duì)穿心蓮生長(zhǎng)、同工酶及藥效成分含量的影響
　　采用單因子隨機(jī)設(shè)計(jì)將盆栽植株分為空白、有機(jī)肥、化肥、微肥4個(gè)處理組，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的穿心蓮進(jìn)行根部施肥，至花期采收，測(cè)定植株株高、分枝數(shù)、葉片數(shù)、單株鮮重等生長(zhǎng)參數(shù)，對(duì)

13、不同肥料處理后穿心蓮葉、莖、根中的過(guò)氧化物酶、酯酶同工酶進(jìn)行電泳分析，并測(cè)定不同肥料組穿心蓮葉中穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分的含量。結(jié)果顯示有機(jī)肥組的穿心蓮植株鮮重和干重最大，微肥次之;施肥后穿心蓮過(guò)氧化物酶和酯酶同工酶酶活性較空白增高，且化肥組穿心蓮根部過(guò)氧化物酶和葉中酯酶活性最高;施肥后穿心蓮葉中有效成分含量增高，微肥組穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯的含量增高最多，為39％，化肥和有機(jī)肥組分別為26％、15％，而化肥組穿心蓮中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量升高最多，

14、為85％，有機(jī)肥和微肥組分別為82％、39％。研究結(jié)果說(shuō)明有機(jī)肥對(duì)穿心蓮的生長(zhǎng)性狀影響較大且有利于脫水穿心蓮內(nèi)酯的生成，微肥有利于穿心蓮內(nèi)酯的積累，肥料的施用可以加強(qiáng)穿心蓮的生理生化水平，因此可以通過(guò)配施有機(jī)肥和微肥提高穿心蓮的產(chǎn)量和質(zhì)量，同時(shí)達(dá)到環(huán)保效果。
　　（三）不同生長(zhǎng)期穿心蓮葉中6種同工酶的變化
　　通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)期穿心蓮葉中過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶、酯酶6種同工酶酶譜進(jìn)行

15、電泳測(cè)定，分析其在不同生長(zhǎng)期的變化規(guī)律。結(jié)果表明穿心蓮葉中的上述6種同工酶均有各自的特征酶帶，酶活性均在花果期明顯增高，其中過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶還產(chǎn)生了新的酶帶，說(shuō)明花果期穿心蓮植株保護(hù)酶活性的升高與其生理作用水平的提高協(xié)調(diào)一致，而酶活性的增高和特征酶帶的產(chǎn)生有利于調(diào)節(jié)其對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的代謝過(guò)程，從而順利度過(guò)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)型期，同時(shí)保護(hù)植株免受有害物質(zhì)損傷，從而使細(xì)胞內(nèi)具備大量剩余能量進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的積累。
　?。ㄋ模}脅迫對(duì)穿心蓮生長(zhǎng)

16、、生理及次生代謝產(chǎn)物的影響
　　通過(guò)設(shè)置空白和四個(gè)鹽度4 dSm-1、8 dSm-1、12 dSm-1、16 dSm-1處理組，對(duì)長(zhǎng)勢(shì)一致的穿心蓮幼苗處理15天后，分析不同鹽濃度條件下穿心蓮的生長(zhǎng)、同工酶及代謝產(chǎn)物變化情況。結(jié)果顯示12 dSm-1是穿心蓮可以耐受的鹽度閾值;隨著鹽濃度的增加，穿心蓮的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，過(guò)高時(shí)植株會(huì)出現(xiàn)葉片卷曲、枯萎甚至脫落的現(xiàn)象，但低于鹽閾值時(shí)，穿心蓮的生長(zhǎng)受限情況不明顯;隨著鹽度的增大，穿心蓮葉和

17、根中的抗氧化酶（過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶）和酯酶酶活性增強(qiáng)，且不同部位同工酶的表現(xiàn)不同;作為評(píng)價(jià)作物細(xì)胞膜受損程度的丙二醛含量逐漸增高，但當(dāng)鹽濃度過(guò)高時(shí)，緩解細(xì)胞受損的脯氨酸含量會(huì)急劇升高以保護(hù)植株生長(zhǎng);在閾值范圍內(nèi)，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯及去氧穿心蓮內(nèi)酯的含量隨著鹽度的增加而增多。說(shuō)明穿心蓮具有一定耐鹽性，且適當(dāng)?shù)柠}處理有利于穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)成分的積累，可以培育具有抗鹽性且有效成分含量高的

18、穿心蓮種質(zhì)。此外，穿心蓮可以作為一種耐鹽作物在鹽堿地中進(jìn)行推廣種植，擴(kuò)大穿心蓮種質(zhì)資源分布面積的同時(shí)有效利用土地資源。在鹽脅迫環(huán)境中，穿心蓮會(huì)通過(guò)自我調(diào)節(jié)不同部位酶活性、生成代謝產(chǎn)物等來(lái)適應(yīng)逆境;當(dāng)脅迫損害加強(qiáng)時(shí)，為了達(dá)到物質(zhì)和能量的恒定狀態(tài)，穿心蓮會(huì)通過(guò)提高酶活性、脯氨酸含量及次生代謝產(chǎn)物含量來(lái)維持植株正常生長(zhǎng)，但次生代謝產(chǎn)物的生成是一個(gè)能量大量損失的過(guò)程，因此當(dāng)鹽脅迫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激危害進(jìn)一步加強(qiáng)時(shí)，穿心蓮開(kāi)始減少次生代謝產(chǎn)物的生成，

19、轉(zhuǎn)而大量生成具有保護(hù)性的小分子物質(zhì)脯氨酸，從而減輕細(xì)胞膜的受損程度。
　?。ㄎ澹┨鸩藟A對(duì)穿心蓮鹽脅迫損傷的緩解作用
　　為了緩解高濃度鹽處理時(shí)穿心蓮的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，將5mM甘氨酸甜菜堿加入到鹽溶液中再對(duì)穿心蓮進(jìn)行處理，至花期采收樣品，測(cè)定生長(zhǎng)參數(shù)、穿心蓮葉、莖、根中的抗氧化酶活性，以及葉和莖中穿心蓮內(nèi)酯的含量。結(jié)果顯示甜菜堿可以緩解鹽脅迫所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損害，鹽度超過(guò)閾值時(shí)穿心蓮未出現(xiàn)葉片卷曲、掉落現(xiàn)象，抗氧化酶活性保持一致

20、，葉和莖中穿心蓮內(nèi)酯的含量隨著鹽度的增高而升高，而且延長(zhǎng)鹽處理時(shí)間后也未出現(xiàn)不良情況。因此，外源甜菜堿可以很好地緩解鹽脅迫對(duì)穿心蓮的生長(zhǎng)抑制作用，同時(shí)保證關(guān)鍵藥效成分穿心蓮內(nèi)酯的含量提高。
　?。┧置{迫對(duì)穿心蓮生長(zhǎng)、同工酶及主要藥效成分的影響
　　采用盆栽試驗(yàn)，單因素隨機(jī)設(shè)計(jì)法設(shè)置土壤相對(duì)含水量100％、40％、20％三個(gè)組，100％為對(duì)照，于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期進(jìn)行水分脅迫，待其長(zhǎng)至花期采收樣品，測(cè)定生長(zhǎng)參數(shù)，穿心蓮葉、莖、根

21、過(guò)氧化物酶(POD)和酯酶(EST)同工酶以及葉中穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分的含量。結(jié)果表明水分脅迫下穿心蓮生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，葉片內(nèi)的POD酶活性和莖中的EST酶活性明顯降低，根內(nèi)POD和EST酶活性幾乎無(wú)變化;40％水分脅迫時(shí)葉中穿心蓮內(nèi)酯的含量較100％升高了30％，脅迫加重時(shí)含量下降，而脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和去氧穿心蓮內(nèi)酯在水分脅迫條件下含量均明顯下降。說(shuō)明穿心蓮在水分脅迫下會(huì)消耗大量能量維持正常生長(zhǎng)，生理酶活性降低，藥效成分生物合成能

22、力減弱;40％水分脅迫時(shí)穿心蓮內(nèi)酯含量的升高可能是抵御環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)。因此穿心蓮的耐旱性較弱，濕潤(rùn)環(huán)境有利于優(yōu)質(zhì)穿心蓮種質(zhì)資源的培育和生產(chǎn)。
　　四、穿心蓮種質(zhì)資源的質(zhì)量評(píng)價(jià)
　　（一）穿心蓮種質(zhì)資源的高效薄層色譜研究
　　研究穿心蓮高效薄層色譜測(cè)定分析方法，對(duì)包括14批不同產(chǎn)地穿心蓮種質(zhì)、14批商品藥材、不同部位以及不同干燥品進(jìn)行了HPTLC指紋圖譜研究，以硅膠GF254高效預(yù)制薄層板，以氯仿-甲苯-甲醇(8

23、0∶10∶15)為展開(kāi)劑，5％硫酸乙醇溶液顯色后，獲得穿心蓮二萜內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)成分的薄層熒光色譜指紋圖譜，經(jīng)指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件(CHROMA1.5)生成共有模式。穿心蓮二萜內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)成分的薄層色譜圖由12個(gè)特征熒光斑點(diǎn)組成，HPTLC指紋圖譜共有模式含有9個(gè)特征峰，相似度分析表明不同商品藥材的相似度存在較大差異。對(duì)比葉、莖、根的模式圖，發(fā)現(xiàn)商品藥材與莖的吻合度最高。HPTLC色譜圖不能較好地顯示不同穿心蓮種質(zhì)資源間的差異。以鮮品為對(duì)照

24、，利用HPTLC方法考察不同干燥方法(包括陰干、曬干、烘干(60℃)、凍干、微波干燥）對(duì)穿心蓮葉中穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)成分的影響，結(jié)果表明干燥后的穿心蓮葉中含有的成分種類(lèi)和數(shù)量均較鮮品多。
　　以氯仿-甲苯-甲醇(70∶10∶15)為展開(kāi)劑，10％三氯化銻氯仿溶液顯色后，獲得穿心蓮根中黃酮類(lèi)化學(xué)成分的薄層色譜直觀(guān)圖譜，由7個(gè)鮮亮的黃色斑點(diǎn)組成（日光下），方法重復(fù)性良好，可為后期穿心蓮黃酮類(lèi)化學(xué)成分的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。因此，利用HPTL

25、C可以對(duì)穿心蓮進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，快速有效區(qū)分穿心蓮不同質(zhì)量級(jí)藥材。
　?。ǘ┐┬纳彿N質(zhì)資源的高效液相色譜研究
　　1.穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)成分的HPLC指紋圖譜研究
　　對(duì)30個(gè)不同產(chǎn)地的穿心蓮種質(zhì)進(jìn)行高效液相色譜指紋圖譜研究，并以廣東省湛江市遂溪縣城月鎮(zhèn)的栽培穿心蓮為標(biāo)準(zhǔn)藥材，選取穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯四個(gè)色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，建立了更具代表性、更加豐富的指紋圖譜共有模式圖，含有20個(gè)共有峰

26、，分離度良好，重現(xiàn)性佳。相似度分析結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地穿心蓮種質(zhì)與對(duì)照穿心蓮間的相似系數(shù)介于0.331～0.995，變化范圍較大，說(shuō)明不同產(chǎn)地穿心蓮種質(zhì)資源間存在明顯的化學(xué)成分表型多樣性。該HPLC方法可以很好地對(duì)不同種質(zhì)穿心蓮進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。
　　2.穿心蓮內(nèi)酯等4種主要成分的含量測(cè)定
　　以穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和去氧穿心蓮內(nèi)酯作為含量測(cè)定指標(biāo)，分別對(duì)不同產(chǎn)地穿心蓮種質(zhì)資源葉、莖中所含上述四個(gè)成分的含量進(jìn)行

27、測(cè)定比較。結(jié)果顯示不同產(chǎn)地穿心蓮葉、莖中含量差別迥異，且葉中的含量差異程度較莖中顯著，說(shuō)明不同產(chǎn)地穿心蓮的質(zhì)量差異主要表現(xiàn)在葉部位。經(jīng)比較廣東產(chǎn)穿心蓮所含穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分含量最高，穿心蓮內(nèi)酯含量高達(dá)54.7 mg·g-1，總內(nèi)酯高達(dá)82.7mg·g-1，因此廣東穿心蓮種質(zhì)資源質(zhì)量最佳，同時(shí)說(shuō)明可在廣東進(jìn)行穿心蓮規(guī)范化種植推廣。光照充足時(shí)穿心蓮總內(nèi)酯在葉中含量較高，而完全背陰時(shí)穿心蓮總內(nèi)酯在莖中含量較高，說(shuō)明光照是影響穿心蓮種質(zhì)質(zhì)量的關(guān)鍵

28、因素之一，是穿心蓮化學(xué)表型多樣性形成的主要因素。
　　分別于一天內(nèi)8:00，11:00，14:00，17:00，20:00采集同一植株的葉片，測(cè)定四個(gè)成分的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯等成分的含量在8:00至17:00這段時(shí)間內(nèi)有升降波動(dòng)，在17:00到20:00時(shí)持續(xù)升高，說(shuō)明光照有利于穿心蓮內(nèi)酯等藥效成分的生物合成。
　　3.溶媒對(duì)穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)成分穩(wěn)定性的影響
　　利用HPLC法檢測(cè)不同溶媒提取液在放置過(guò)程中5

29、個(gè)主要成分的含量變化，探討溶媒對(duì)其化學(xué)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示甲醇、乙醇及其醇水混合溶媒對(duì)5個(gè)化學(xué)成分的提取率較高，但是隨著溶媒極性的增大其化學(xué)穩(wěn)定性降低;常溫條件下，以甲醇為溶媒，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和去氧穿心蓮內(nèi)酯在放置過(guò)程中含量會(huì)升高，但3天后開(kāi)始下降，在HPLC圖譜中顯示峰較明顯的X1和X2成分則一直下降;在甲醇水溶液中，五個(gè)指標(biāo)成分的含量一直下降;在乙醇、85％EtOH中，五個(gè)指標(biāo)成分3天內(nèi)均較穩(wěn)定。85％乙醇提取液高溫處

30、理后，穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量均升高，2h后僅脫水穿心蓮內(nèi)酯仍升高，而X1和X2一直減少;低溫放置過(guò)程中，各成分基本保持不變。85％乙醇為實(shí)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分較高提取率、穩(wěn)定、環(huán)保的最佳溶媒;放置過(guò)程中，穿心蓮內(nèi)酯的含量下降并不是轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮導(dǎo)致的，還有其它成分參與的復(fù)雜轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)化;穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分分析過(guò)程中應(yīng)注意溶媒的選擇，且不宜長(zhǎng)時(shí)間放置;生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)該對(duì)其環(huán)境溫度進(jìn)行隨時(shí)監(jiān)測(cè)，盡量控制在低溫狀態(tài)下。

31、>　?。ㄈ┎煌a(chǎn)地穿心蓮中重金屬及農(nóng)殘檢測(cè)
　　1.電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地穿心蓮藥材中19種金屬元素含量
　　建立應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)定穿心蓮藥材中19種微量元素（包括鈉、鎂、鋁、硅、鉀、鈦、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、砷、銀、鎘、錫、汞、鉛）含量的測(cè)定方法。樣品經(jīng)微波消化后直接采用八極桿碰撞/反應(yīng)池技術(shù)結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示測(cè)定方法中所有元素的

32、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)(r)都大于0.9990，檢出限在0.001～0.051μ g·kg-1之間，重復(fù)性和穩(wěn)定性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都小于10％，藥材的加標(biāo)回收率在88.64％～102.98％之間，符合痕量分析的要求。本方法檢出限低、操作簡(jiǎn)單、快速，且靈敏度高，可作為穿心蓮藥材中微量元素的定量分析。
　　2.氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(GC-63Ni-ECD)法測(cè)定穿心蓮藥材中22種農(nóng)藥殘留
　　采用GC-ECD法建立藥材中16種

33、有機(jī)氯和6種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的同時(shí)測(cè)定方法。用弗羅里硅土萃取凈化樣品后，GC-ECD測(cè)定，ZB-1701P彈性石英毛細(xì)管柱程序升溫分離，載氣為高純N2，柱流量1.45 mL·min-1，不分流進(jìn)樣1μL。弗羅里硅土固相萃取能有效凈化藥材樣品中雜質(zhì)，檢測(cè)限為0.1～3.0μ g·kg-1，平均回收率為82.31～120.01％(RSD0.68～3.41％，n=6)。所建立的方法能同時(shí)測(cè)定藥材中22種有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量，方