IK1通道激動(dòng)劑zacopride抗大鼠冠脈阻斷后缺血性心律失常的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心律失常是臨床常見、危害性較大的心律失常。目前臨床應(yīng)用的抗心律失常藥物幾乎全部是各種離子通道阻斷劑，在發(fā)揮治療心律失常效應(yīng)的同時(shí)，很容易發(fā)生因某些離子電流的不適當(dāng)阻斷而出現(xiàn)的新的電活動(dòng)紊亂，因而有可能同時(shí)存在一定的致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。
　　內(nèi)向整流鉀電流（inward rectifier potassium current，IK1）是心肌最主要的背景外向電流，參與心肌靜息膜電位（resting membr

2、ane potential，RMP）的維持和動(dòng)作電位（action potential，AP）3期終末的復(fù)極。IK1的改變必將影響心肌RMP的穩(wěn)定和AP的復(fù)極，從而對(duì)心肌的興奮性和心律失常的發(fā)生產(chǎn)生深刻影響。
　　大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，急性心肌缺血和慢性心肌梗死時(shí)發(fā)生的心律失常與IK1的下降有關(guān)。因此，我們?cè)O(shè)想，IK1的減弱可能參與了由缺血性心臟疾病引起的心律失常的發(fā)生。我們最近報(bào)道了zacopride是一個(gè)選擇性的大鼠心室肌

3、IK1通道激動(dòng)劑，可以增強(qiáng) IK1電流，而對(duì)其余心室肌主要的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體電流均無(wú)顯著影響，我們推測(cè)zacopride做為首個(gè)選擇性激動(dòng)心肌IK1通道的工具藥，可以通過(guò)激動(dòng)IK1/Kir2.1通道進(jìn)而增大或恢復(fù)RMP而發(fā)揮抗缺血性心律失常作用。
　　為了證實(shí)這一設(shè)想，本研究擬明確IK1激動(dòng)劑zacopride對(duì)急性缺血和慢性心梗致心律失常的抑制作用；通過(guò)觀測(cè)zacopride在缺氧條件下對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1電流、RMP、AP和

4、延遲后除極（delayed after depolarizations，DADs）的作用，以分析其抗缺血性心律失常的電生理機(jī)制；通過(guò)觀測(cè)zacopride對(duì)正常大鼠干預(yù)后IK1電流的變化以及對(duì)大鼠急性模擬缺血模型、慢性心梗模型心肌組織Kir2.1蛋白表達(dá)的影響，分析其抗缺血性心律失常的分子機(jī)制。
　　目的：
　　1.建立大鼠急性缺血性心律失常模型，觀察IK1激動(dòng)劑zacopride對(duì)急性缺血性心律失常的影響。
　　2.

5、建立離體低氧灌流系統(tǒng)，觀察zacopride在缺氧條件下對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1電流、ATP敏感鉀電流（ATP-sensitive potassium current，IKATP）、RMP、AP、DADs的影響，以及在缺氧條件下對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary cell，CHO cell）轉(zhuǎn)染Kir2.x通道的影響。
　　3.建立大鼠心肌細(xì)胞急性模擬缺血模型，觀察zacopride對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1

6、蛋白表達(dá)的影響。
　　4.建立大鼠慢性缺血性心律失常模型，利用遙測(cè)心電圖監(jiān)測(cè)zacopride對(duì)清醒大鼠慢性缺血性心律失常的影響，對(duì)Iso誘發(fā)的心律失常的影響及對(duì)慢性缺血心肌Kir2.1蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.大鼠急性缺血性心律失常模型的制備、實(shí)驗(yàn)分組、觀測(cè)指標(biāo)
　　造模方法：成年雄性SD大鼠，麻醉，開胸，記錄心電圖（electrocardiogram，ECG），結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左心室前降支，分別于結(jié)扎

7、前3分鐘、結(jié)扎后3分鐘及結(jié)扎后發(fā)生首次持續(xù)性室速或室顫（sustained ventricular tachycardia or ventricular fibrillation，Sus VT/VF）30秒時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，觀測(cè)藥物干預(yù)至冠脈結(jié)扎后15分鐘內(nèi)II導(dǎo)聯(lián)ECG的變化。
　　實(shí)驗(yàn)分組：首先按給藥干預(yù)的時(shí)間點(diǎn)分成3組，即：冠脈結(jié)扎前3分鐘、結(jié)扎后3分鐘、結(jié)扎后首次Sus VT/VF30秒處理組。上述每組再按藥物干預(yù)的種類和劑

8、量分為：對(duì)照組、zac5.0μg/kg組、zac15μg/kg組、zac50μg/kg組、利多卡因（lidocaine，Lidoc）組。
　　觀測(cè)指標(biāo)：累計(jì)室性期前收縮（premature ventricular contraction，PVC）次數(shù)，室速（ventricular tachycardia，VT）持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率，室顫（ventricular fibrillation，VF）持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率，冠脈結(jié)扎至發(fā)生首次Sus

9、 VT/VF的時(shí)間和首次Sus VT/VF的終止時(shí)間。
　　2.缺氧條件下細(xì)胞膜電流和膜電位的記錄
　　采用膠原酶法急性分離大鼠左室心肌細(xì)胞，建立離體低氧灌流系統(tǒng)，維持測(cè)試細(xì)胞在測(cè)試期間氧分壓低于50 mmHg，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄IK1電流和IKATP電流；在電流鉗模式下（全程用10μmol/Lglibenclamide阻斷IKATP）觀測(cè)大鼠心室肌細(xì)胞RMP、AP和分別由缺氧或Iso誘發(fā)的DADs。<

10、br>　　3.大鼠心肌Kir2.1、Kir2.2、和Kir2.3的異源表達(dá)和缺氧條件下膜電流的記錄
　　通過(guò)RT-PCR法獲得大鼠心肌Kir2.1、Kir2.2和Kir2.3基因，將上述基因插入質(zhì)粒pEGFP-N1，將其轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞，建立離體低氧灌流系統(tǒng)（PO2<50 mmHg），應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在電壓鉗模式下觀測(cè)缺氧條件下CHO細(xì)胞的 Kir2.1、Kir2.2、Kir2.3電流。
　　4.大鼠心肌細(xì)胞急性模擬缺

11、血（simulated ischemia，SI）模型的制備和實(shí)驗(yàn)分組
　　造模方法：取3只健康成年雄性SD大鼠，采用膠原酶法急性分離左心室肌細(xì)胞，梯度復(fù)鈣（Ca2+終濃度1.8 mmol/L）后用不同濃度zacopride進(jìn)行干預(yù)，孵育后離心，在上清液上層滴加礦物油以隔絕空氣，造成模擬缺血。
　　實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、SI組、zac0.3μmol/L組、zac1.0μmol/L組、zac3.0μmol/L組。
　　觀測(cè)

12、指標(biāo)：用Western Blot方法檢測(cè)不同組別大鼠心室肌細(xì)胞IK1蛋白表達(dá)。
　　5.大鼠慢性缺血性心律失常模型的制備、實(shí)驗(yàn)分組、觀測(cè)指標(biāo)
　　造模方法：成年雄性SD大鼠，麻醉，開胸，記錄心電圖，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左心室前降支，建立心梗（myocardial infarction，MI）模型，并將心電發(fā)射子植入腹腔，將裝有大鼠的鼠籠置于信號(hào)接收板上，動(dòng)物蘇醒后采用心電遙測(cè)記錄系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)，觀察大鼠清醒狀態(tài)下ECG的改變，每天24

13、小時(shí)監(jiān)測(cè)，連續(xù)4周。
　　實(shí)驗(yàn)分組：MI組、MI+zac組、假手術(shù)（sham）組、sham+zac組。
　　觀測(cè)指標(biāo)：
　?、贆z測(cè)指標(biāo)：每只大鼠24小時(shí)室上性期前收縮（super premature ventricular contraction，SPVC）次數(shù)、傳導(dǎo)阻滯（conduction block，CB）次數(shù)、PVC次數(shù)和VT持續(xù)時(shí)間，作為每只動(dòng)物每實(shí)驗(yàn)日的數(shù)據(jù)，分組計(jì)算每一監(jiān)測(cè)指標(biāo)的平均值并進(jìn)行組間比較。

14、r>　?、?Iso誘發(fā)的遙測(cè)大鼠心律失常
　　實(shí)驗(yàn)于遙測(cè)大鼠4周末處死前進(jìn)行。全部不同組別的大鼠均給予Iso1280μg/kg尾靜脈注射，檢測(cè)每只動(dòng)物1小時(shí)內(nèi) PVC發(fā)生次數(shù)和發(fā)生率，VT持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率，VF持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率，分組統(tǒng)計(jì)平均值并進(jìn)行組間比較。
　　③遙測(cè)大鼠4周末處死，用Western Blot方法檢測(cè)遙測(cè)大鼠心肌Kir2.1蛋白的表達(dá)，觀測(cè)不同組別的大鼠心肌組織Kir2.1的蛋白表達(dá)。
　　6.IK1

15、電流長(zhǎng)期變化的觀測(cè)
　　分為正常對(duì)照組和zac組，分別于給藥前和給藥后的1、2、3、4周末采用膠原酶法急性分離兩組大鼠左室心肌細(xì)胞，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄IK1電流的變化。
　　結(jié)果：
　　1.zacopride對(duì)大鼠急性缺血性心律失常的抑制作用
　　在5.0-50μg/kg的劑量范圍內(nèi)，zacopride可顯著抑制心律失常的發(fā)生，呈劑量依賴性，15μg/kg為zacopride抗心律失常最大效

16、應(yīng)劑量。
　?。?）冠脈結(jié)扎前3分鐘藥物干預(yù)
　　與對(duì)照組比，zac（15μg/kg）組出現(xiàn)心律失常的時(shí)間由334.3±16.5 s延長(zhǎng)至465.5±23.2 s；PVC次數(shù)由158±34降至50±7；VT持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率由55.8±10.2 s，100％降至0.6±0.6 s，12.5%；VF持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率由5.1±2.0 s，62.5%降至0 s，0%；其抗心律失常的效應(yīng)與陽(yáng)性對(duì)照藥利多卡因相似（P>0.05）。

17、>　?。?）冠脈結(jié)扎后3分鐘藥物干預(yù)
　　與對(duì)照組比，zac（15μg/kg）組出現(xiàn)心律失常的時(shí)間由335.6±11.8 s延長(zhǎng)至447.1±26.1 s；PVC次數(shù)由105±18降至14±5；VT持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率由51.9±12.3 s，100%降至1.8±0.9 s，37.5%；VF持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率由4.4±1.7 s，75.0%降至0 s，0%；其抗心律失常的效應(yīng)與陽(yáng)性對(duì)照藥利多卡因相似（P>0.05）。
　　（3）冠

18、脈結(jié)扎后首個(gè)Sus VT/VF30秒藥物干預(yù)
　?、俑鹘M冠脈結(jié)扎至出現(xiàn)首個(gè)Sus VT/VF的時(shí)間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P>0.05）。
　?、谂c對(duì)照組比，zac（15μg/kg）組終止首次Sus VT/VF時(shí)間由129.8±54.5 s降至27.5±5.5 s，后續(xù)發(fā)生PVC的次數(shù)由110±21降至26±10，VT持續(xù)時(shí)間由191.4±55.4 s降至51.9±10.9 s，VF持續(xù)時(shí)間由30.1±11.0 s降至0 s，其抗

19、心律失常的效應(yīng)與陽(yáng)性對(duì)照藥利多卡因相似（P>0.05）。
　　2.缺氧條件下zacopride對(duì)大鼠心肌細(xì)胞IK1電流、IKATP電流和RMP、AP、DADs的影響
　?。?）缺氧條件下IK1外向電流明顯被抑制，從常氧時(shí)的2.4±0.2 pA/pF（-60 mV）減小到1.3±0.3 pA/pF（-60 mV），zacopride可劑量依賴性激動(dòng)IK1，1μmol/L為其最大效應(yīng)劑量，可使IK1電流恢復(fù)至接近常氧狀態(tài)的水平2

20、.3±0.1 pA/pF（-60 mV），外向電流平均增量為76.9%，1μmol/L BaCl2可以逆轉(zhuǎn)缺氧時(shí)zacopride對(duì)IK1的激動(dòng)效應(yīng)，外向電流衰減為1.5±0.2 pA/pF（-60 mV）。
　?。?）缺氧條件下，鉗制心肌細(xì)胞電位至+20 mV，持續(xù)約15 min時(shí)，IKATP被激活，缺氧30 min時(shí)加入1μmol/Lzacopride，對(duì)IKATP無(wú)明顯影響，激活的IKATP可以被glibenclamide（

21、10μmol/L）所阻斷。
　?。?）心肌細(xì)胞缺氧時(shí)，RMP明顯減?。ㄈO化），給予1μmol/Lzacopride可使其恢復(fù)至接近常氧水平，而1μmol/L BaCl2可以逆轉(zhuǎn)zacopride對(duì)RMP的效應(yīng)。
　?。?）缺氧條件下，心肌細(xì)胞動(dòng)作電位幅度（action potential amplitude，APA）降低（從113.80±2.31至89.27±7.40），動(dòng)作電位時(shí)程（action potential du

22、ration，APD）明顯延長(zhǎng)（ADP50從12.64±0.34 ms至20.38±1.86 ms；ADP90從31.8±0.7 ms至48.6±3.6 ms），給予1μmol/Lzacopride可以使APA、ADP50和APD90恢復(fù)至接近常氧水平（109.20±4.14；13.60±0.17 ms；33.8±1.1 ms），1μmol/L BaCl2可以逆轉(zhuǎn)zacopride對(duì)APA和APD的效應(yīng)。
　?。?）zacopri

23、de可顯著抑制缺氧及Iso導(dǎo)致的DADs的發(fā)生。在缺氧條件下，1μmol/Lzacopride使其發(fā)生率由73.3%降至20.0%；由Iso誘發(fā)的DADs，1μmol/Lzacopride使其發(fā)生率由66.6%降至13.3%。zacopride對(duì)兩種DADs模型的抑制作用均可被1μmol/L BaCl2消除。
　　3.缺氧條件下zacopride對(duì)異源表達(dá)的Kir2.x電流的效應(yīng)
　?。?）缺氧條件下，CHO細(xì)胞上表達(dá)的Ki

24、r2.1外向電流明顯被抑制，從7.6±0.3 pA/pF（-60 mV）到5.8±0.3 pA/pF（-60 mV）。zacopride可劑量依賴性激動(dòng)Kir2.1通道，100μmol/L為其最大效應(yīng)劑量，可使其恢復(fù)至接近常氧水平7.4±0.3 pA/pF（-60 mV），外向電流平均增量為27.6%。
　?。?）缺氧條件下，zacopride對(duì)Kir2.2、Kir2.3電流無(wú)顯著作用。
　　4.zacopride可上調(diào)急性

25、模擬缺血心肌細(xì)胞IK1蛋白表達(dá)
　　模擬缺血條件下，在0.3-3.0μmol/L的劑量范圍內(nèi)，zacopride可恢復(fù)甚至增加由模擬缺血造成的大鼠心室肌細(xì)胞IK1蛋白表達(dá)的下降，1μmol/L為其最大效應(yīng)濃度。
　　5.zacopride對(duì)清醒大鼠慢性缺血性心律失常的抑制
　　zacopride顯著減少了大鼠心梗后4周內(nèi)室性心律失常和房室傳導(dǎo)阻滯的發(fā)生，但對(duì)室上性心律失常無(wú)明顯作用。
　?。?）各組大鼠存活率沒有

26、顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　?。?）在心電遙測(cè)記錄的4周期間，MI組大鼠心律失常的發(fā)生明顯高于其他各組。MI組PVC、VT/VF在第一天及第四周增多特別明顯，而MI+zac組PVC與VT/VF在四周內(nèi)均穩(wěn)定維持在與sham組相近的低水平。MI組CB在第1天和第2周明顯增多，MI+Zac組則在4周內(nèi)始終穩(wěn)定在較低水平。MI組SPVC四周內(nèi)呈持續(xù)增多趨勢(shì)，MI+Zac組在前3周亦呈相似的增多趨勢(shì)。
　　（3）與MI組比

27、，MI+Zac組每只大鼠每天SPVC次數(shù)沒有明顯變化（P>0.05），CB次數(shù)、PVC次數(shù)及VT/VF持續(xù)時(shí)間均明顯降低（P<0.05），分別由79±15降至36±7；461±137降至90±48；59±26 s降至12±12 s。
　　6. Zac e抑制Iso誘發(fā)的清醒慢性心梗模型大鼠心律失常
　　在心電遙測(cè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谔幩狼埃察o脈注射Iso可誘發(fā)IM組和sham組大鼠發(fā)生顯著的心律失常，zacopride干預(yù)的兩組P

28、VC、VT、VF次數(shù)和發(fā)生率均顯著降低（P<0.05），與MI組相比，zacopride干預(yù)組PVC次數(shù)和發(fā)生率由1073±172，100%降至44±29，25%，VT、VF持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率分別由109.2±30.0，80%降至0，0%；21.8±13.4，40%降至0，0%。與sham組比，zacoprid干預(yù)組PVC次數(shù)和發(fā)生率由981±95，100%降至42±29，22.2%；VT持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率由8.7±6.4，22.2%降至0

29、，0%。
　　7.zacoprid可恢復(fù)慢性心梗模型大鼠已下調(diào)的心室Kir2.1的蛋白表達(dá)
　　與sham組相比，MI組心室Kir2.1的蛋白表達(dá)明顯下降，而MI+Zac組，心室Kir2.1的蛋白表達(dá)上調(diào)，甚至超過(guò)sham組；sham+Zac組心室Kir2.1的蛋白表達(dá)增高更為明顯（P<0.01）。
　　8.zacoprid增強(qiáng)正常大鼠IK1電流
　　zacoprid逐周增大正常大鼠心肌細(xì)胞IK1外向電流，3周后

30、心室肌IK1外向電流明顯增強(qiáng)，大于0周和相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組數(shù)值（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.特異性IK1激動(dòng)劑zacopride對(duì)大鼠冠脈阻斷后發(fā)生的急性（15分鐘內(nèi)）和慢性（4周內(nèi)）缺血性心律失常均具有顯著抑制作用。
　　2.缺氧條件下，zacopride可通過(guò)激活大鼠心室肌細(xì)胞IK1而恢復(fù)細(xì)胞被去極化的RMP、縮短延長(zhǎng)的APD、抑制DADs的發(fā)生，是其抑制缺血性心律失常的重要機(jī)制。
　　3.在缺氧條