利用兔左心室冠脈灌流楔形標(biāo)本評(píng)價(jià)hERG鉀通道開(kāi)放劑的抗心律失常作用.pdf

1、心肌細(xì)胞膜上各種離子通道有序的開(kāi)放和關(guān)閉是心臟正常電活動(dòng)的基礎(chǔ)，動(dòng)作電位形狀、時(shí)程取決于去極化和復(fù)極化離子流之間相互的精細(xì)平衡。一旦這種平衡被打破，復(fù)極過(guò)程中外向電流的減小或者內(nèi)向電流的增大均可導(dǎo)致心肌復(fù)極的延遲。其中，由human ether-a-go-go-related(hERG)基因編碼的鉀通道在動(dòng)作電位復(fù)極化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，鑒于這種由心肌復(fù)極延遲導(dǎo)致的長(zhǎng)QT綜合癥(LQTS)，為降低新藥研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，各制藥企業(yè)更加注重藥物對(duì)h

2、ERG通道影響的篩選，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些化合物具有激活hERG通道的作用。
　　近幾年的研究表明，可引發(fā)LQTS的藥物最主要的原因是這些藥物具有阻斷hERG通道的作用，hERG通道在動(dòng)作電位復(fù)極化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是由于心室肌各層細(xì)胞hERG通道分布密度的不同，心肌細(xì)胞復(fù)極結(jié)束時(shí)間有所不同，心室肌細(xì)胞的這種跨壁復(fù)極的不均一性稱(chēng)之為跨壁復(fù)極離散度(transmural dispersion of repolarization，

3、IDR)。藥物與通道的結(jié)合阻斷通道，減少?gòu)?fù)極電流，動(dòng)作電位復(fù)極延遲易發(fā)早后除極(EAD)，引發(fā)觸發(fā)活動(dòng)。而藥物不同程度延遲心肌復(fù)極，導(dǎo)致TDR的增大為異常興奮的折返提供了條件，出現(xiàn)室性快速性心律失常，特別是尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過(guò)速(Torsades de Pointes，TdP)，TdP很容易轉(zhuǎn)為室顫而致猝死。
　　試驗(yàn)表明，hERG通道激活劑通過(guò)對(duì)通道不同機(jī)制的調(diào)控增加hERG電流、縮短心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)，提示，hE

4、RG通道激活劑有望成為對(duì)抗藥物誘發(fā)特別是藥物阻斷hERG通道所致LQTS的特異性治療藥物。本實(shí)驗(yàn)采用的hERG通道激活劑ICA-105574(ICA)通過(guò)與通道結(jié)合，抑制hERG通道的失活過(guò)程，從而增大電流強(qiáng)度加速心肌復(fù)極。然而關(guān)于ICA是否能夠?qū)顾幬镎T發(fā)的EAD和Tdp以及其自身是否具有潛在的致心律失常作用的報(bào)導(dǎo)不多。
　　“兔左心室冠脈灌流楔形標(biāo)本模型”能夠同步記錄心內(nèi)膜下心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位和跨壁心電圖，能同時(shí)反映APD、T

5、DR及ECG的變化。因此本實(shí)驗(yàn)擬利用“兔左室冠脈灌流楔形標(biāo)本模型”觀察hERG通道激活劑對(duì)APD、TDR及ECG的影響，了解hERG通道激活劑對(duì)組織水平作用的電生理特點(diǎn)。觀察hERG通道激活劑對(duì)常見(jiàn)的藥物(莫西沙星、多非利特)誘發(fā)EAD、TdP的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將對(duì)hERG通道激活劑潛在的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　一 hERG通道激活劑ICA對(duì)正常心肌電生理的影響
　　目的：觀察激活劑ICA對(duì)家兔正常心肌組織APD和TDR的影響

6、
　　方法：體重2.0～2.5 kg，兔齡3～4個(gè)月的健康雌性新西蘭兔，耳緣靜脈注射肝素(600～800 IU/kg)抗凝，10～15分鐘后靜脈注射戊巴比妥鈉(30～35 mg/kg)麻醉，開(kāi)胸迅速取出心臟，放入4℃低溫臺(tái)式液中，以低溫停跳液(KCI為24 mmol/L、不含Ca2+的臺(tái)氏液)從主動(dòng)脈逆行灌流沖洗冠狀動(dòng)脈內(nèi)殘留血液并使心臟停跳。將靜脈留置針頭經(jīng)主動(dòng)脈左竇開(kāi)口處插入冠狀動(dòng)脈左側(cè)回旋支，用縫合線(xiàn)結(jié)扎固定，之后迅速剪去未

7、灌流部位心肌(灌流的心肌部分呈淺粉色，未灌流的心肌部分呈紅色)，制成左心室動(dòng)脈灌流楔形標(biāo)本。利用“離體兔冠脈灌流心室楔狀標(biāo)本”記錄心肌內(nèi)膜下細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程復(fù)極90％的時(shí)間(APD90)和跨壁心電圖(ECG)，觀察在1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L濃度下ICA對(duì)APD90的影響，以及給予10μmol/L ICA前后不同刺激頻率下(0.2Hz，1Hz，2Hz)APD90和Tp-e(為T(mén)波的峰值與T波終點(diǎn)之間的時(shí)程，一般認(rèn)為

8、該時(shí)程間接反映跨壁復(fù)極離散度)的變化
　　結(jié)果：
　　(1)ICA(10μmol/L)對(duì)內(nèi)，外膜下心肌細(xì)胞的APD90縮短百分率分別為45.5％和34.6％，可見(jiàn)ICA對(duì)內(nèi)膜下心肌細(xì)胞APD90縮短更為顯著，故實(shí)驗(yàn)均同步記錄內(nèi)膜下心肌細(xì)胞動(dòng)作電位和ECG。
　　(2)0.5 Hz刺激頻率下，1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L ICA分別縮短心肌內(nèi)膜下細(xì)胞APD9010.4％，21.8％，40.8％。

9、>　　(3)給予10μmol/L ICA后在0.2Hz，1 Hz，2 Hz的頻率下分別刺激，APD90的縮短率分別為34.2％，18.4％，17.7％，在給予ICA前后Tp-e由86±5 ms變化到83±8 ms，無(wú)明顯變化。
　　(4)10μmol/L ICA，2HZ刺激頻率下能夠誘發(fā)EAD，發(fā)生率為4/6。
　　結(jié)論：ICA對(duì)內(nèi)膜下心肌細(xì)胞APD90縮短更為顯著，可濃度依賴(lài)性的縮短心肌內(nèi)膜下細(xì)胞APD90，高濃度ICA(

10、10μmol/L)使心肌組織正常的頻率依賴(lài)性喪失，并且在2Hz刺激頻率下容易誘發(fā)EAD，提示ICA可能具有潛在的致心律失常作用。
　　二 hERG通道激活劑ICA對(duì)莫西沙星和多非利特誘發(fā)心律失常的影響
　　目的：觀察ICA對(duì)莫西沙星和多非利特誘發(fā)EAD，QT間期延長(zhǎng)的影響
　　方法：參考第一部分實(shí)驗(yàn)方法制備“離體兔冠脈灌流心室楔狀模型”，利用“離體兔冠脈灌流心室楔狀模型”在0.2HZ刺激頻率下分別記錄給予莫西沙星(10

11、0μmol/L)，多非利特(100 nmol/L)后心肌內(nèi)膜下細(xì)胞動(dòng)作電位APD90和Tp-e/QT比值(為T(mén)波的峰值與T波終點(diǎn)之間的時(shí)程與QT間期之間的比值，常作為藥物致TdP的預(yù)測(cè)指標(biāo))的變化，以及在此基礎(chǔ)上給予10μmol/L ICA后心肌內(nèi)膜下細(xì)胞APD90和Tp-e/QT比值的變化。觀察ICA對(duì)兩種藥物誘發(fā)EAD，QT間期延長(zhǎng)的影響
　　結(jié)果：
　　(1)給予莫西沙星(100μmol/L)之后，APD90由299±

12、13 ms延長(zhǎng)至434±22 ms(p<0.05)，Tp-e間期由75±5 ms延長(zhǎng)至199±8 ms(p<0.01)，EAD發(fā)生率為3/6，Tp-e/QT比值增加68.7％。在此基礎(chǔ)上給予10μmol/LICA之后APD90縮短至266μ12 ms，(與莫西沙星藥前相比p>0.05)，Tp-e間期恢復(fù)至90±4 ms(與給予莫西沙星藥前相比p>0.05)，Tp-e/QT比值與莫西沙星藥前相比沒(méi)有明顯變化，未見(jiàn)EAD的發(fā)生。
　　

13、(2)給予多非利特(100 nmol/L)后APD90由正常的270±8 ms延長(zhǎng)至386±3 ms(p<0.05)，Tp-e間期由105±10 ms延長(zhǎng)至302±11ms(p<0.01)，EAD發(fā)生率為5/6，Tp-e/QT比值增長(zhǎng)86％。在此基礎(chǔ)上給予10μmol/L ICA之后APD90縮短至283±3 ms，(與多非利特藥前相比p>0.05)，Tp-e間期恢復(fù)至98±6 ms(與給予多非利特藥前相比p>0.05)，Tp-e/QT