ILK對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注室性心律失常的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　缺血再灌注室性心律失常是心梗采用溶栓或冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后血管再通所致的常見(jiàn)臨床現(xiàn)象，其發(fā)生率較高，也是引起心血管臨床事件的主要原因之一，因此怎樣減少缺血再灌注所誘發(fā)的室性心律失常已成為目前臨床心血管病介入治療以及防治缺血性心臟病的研究熱點(diǎn)。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是在多類(lèi)組織、細(xì)胞中普遍表達(dá)的介導(dǎo)胞外信號(hào)分子調(diào)節(jié)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵蛋白激酶，參與了細(xì)胞增殖、分化、遷移

2、以及血管再生等多種細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)。大量研究表明ILK在心臟結(jié)構(gòu)、功能的調(diào)節(jié)以及心臟疾?。ㄈ缧氖曳屎?、心肌病、心梗等）的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用。然而，ILK是否在缺血再灌注室性心律失常的發(fā)生中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用及可能的調(diào)控機(jī)制如何，目前未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。既往有大量研究證實(shí)縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)在心律失常的發(fā)生中具有重要作用，上調(diào)Cx43的表達(dá)、促進(jìn)其磷酸化以及抑制其重塑均可減少再灌注心律失常的產(chǎn)生。然而，下

3、調(diào)心肌ILK表達(dá)可引起Cx43的表達(dá)的下降，提示ILK可能參與調(diào)節(jié)Cx43信號(hào)分子介導(dǎo)的相關(guān)功能。近年有報(bào)道，Akt可通過(guò)磷酸化Cx43-373位點(diǎn)，穩(wěn)定Cx43在閏盤(pán)處的分布，抑制Cx43重塑，然而ILK作為Akt的上游信號(hào)分子，可直接或間接磷酸化Akt-473位點(diǎn)，調(diào)節(jié)Akt的活性。因此，我們推測(cè)ILK可通過(guò)Akt調(diào)控Cx43靶點(diǎn)間接預(yù)防再灌注室性心律失常的發(fā)生。為此我們采用缺血再灌注心律失常模型研究ILK在大鼠缺血再灌注室性心律失

4、常中的作用以及可能的調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)研究Cx43在ILK調(diào)節(jié)再灌注室性心律失常中的作用。
　　研究方案及重要方法：
　　1.ILK在心臟缺血再灌注室性心律失常中的作用
　　為研究ILK在缺血再灌注心律失常中的作用，我們采用Langendorff系統(tǒng)構(gòu)建離體心臟缺血再灌注心律失常模型，給予ILK激動(dòng)劑LPTP、抑制劑Cpd22預(yù)處理心臟，分為Sham組、I/R組、I/R+Cpd22組、I/R+LPTP組、I/R+Cpd22

5、+LPTP組，記錄并觀察比較各組心律失常發(fā)生情況。
　　2.明確Cx43在ILK改善心臟再灌注室性心律失常中的作用
　　為研究Cx43在ILK改善心臟再灌注室性心律失常中的作用，我們將上述5組心臟組織分別提取組織蛋白，采用蛋白印跡法檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá)水平的改變，同時(shí)通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)Cx43的分布。
　　3.研究ILK調(diào)控Cx43的機(jī)制
　　(1)首先，我們分別取Sham組、I/R組、I/R+Cpd22組、I/

6、R+LPTP組、I/R+Cpd22+LPTP組各組心臟組織提取蛋白，采用蛋白印跡法檢測(cè)p-Akt473位點(diǎn)的表達(dá)情況，明確予ILK活性調(diào)節(jié)劑預(yù)處理后p-Akt473的改變情況;
　　(2)為研究Akt在ILK調(diào)節(jié)Cx43中的作用，我們給予Akt抑制劑MK2206阻斷Akt，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為Sham組、I/R組、I/R+LPTP組、I/R+MK2206+LPTP組，觀察各組再灌注室性心律失常的發(fā)生情況，并提取各組心臟組織蛋白，采用蛋白

7、印跡法檢測(cè)各組Cx43及p-Akt473的表達(dá)情況，同時(shí)采用免疫熒光法檢測(cè)Cx43的分布情況。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分:ILK對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注室性心律失常的影響
　　1.抑制ILK顯著加重心臟缺血再灌注室性心律失常發(fā)生;
　　2.ILK激動(dòng)劑可明顯減輕再灌注室性心律失常的嚴(yán)重程度，而且該效果可被ILK抑制劑所消除。
　　第二部分:Cx43在ILK保護(hù)缺血再灌注室性心律失常中的作用
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8、.ILK活性調(diào)節(jié)劑預(yù)處理后各組心肌組織總的Cx43的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變。
　　2.ILK激動(dòng)劑可穩(wěn)定心臟缺血再灌注后Cx43在閏盤(pán)處的分布，相反，ILK抑制劑可促進(jìn)心臟缺血再灌注后Cx43的側(cè)面化，并阻斷ILK激動(dòng)劑抑制Cx43重新分布的作用。
　　第三部分:Akt在ILK調(diào)控Cx43重塑中的作用
　　Akt抑制劑預(yù)處理后再予ILK激動(dòng)劑處理發(fā)現(xiàn)，Akt抑制劑可拮抗ILK激動(dòng)劑的抗缺血再灌注室性心律失常的作用，同時(shí)