ATP敏感性鉀通道在硫化氫對抗高糖損傷成骨細(xì)胞中的作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景及目的:
  糖尿病性骨病在頜骨有骨量減少和骨質(zhì)疏松的表現(xiàn),需要接受正畸治療的糖尿病患者中,Ⅰ型糖尿病青少年患者常因咬合問題和頜骨發(fā)育異常就診,Ⅱ型糖尿病成人患者常因牙周退化和咬合問題就診。正畸治療的成功在很大程度上取決于骨的改建能力,正畸力產(chǎn)生的組織反應(yīng)不僅與牙周、頜骨局部因素有關(guān),也與影響骨代謝的全身因素、激素和細(xì)胞因子有關(guān)。如何防止糖尿病患者正畸治療中的骨喪失,促進(jìn)骨修復(fù)重建一直受到口腔正畸學(xué)者的關(guān)注。
  糖尿病

2、導(dǎo)致骨代謝異常的機(jī)制尚未完全闡明,目前的研究認(rèn)為骨代謝異常的中心環(huán)節(jié)是成骨細(xì)胞(Osteoblast,OB)功能障礙,高糖(high glucose,HG)可直接抑制OB功能,骨形成受到抑制,鈣和維生素D代謝紊亂影響骨轉(zhuǎn)換水平,進(jìn)而導(dǎo)致骨礦化障礙引起骨代謝異常。應(yīng)用合適的藥物防止高糖對OB功能的損傷,是治療與骨代謝相關(guān)疾病的迫切需要。
  硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是一種新型的氣體信號分子和細(xì)胞保護(hù)劑,是繼

3、一氧化氮和一氧化碳之后的第三種內(nèi)源性氣體信號分子。現(xiàn)已證明OB(Osteoblast,OB)中存在內(nèi)源性H2S,生理濃度的增加可促進(jìn)OB分化,在骨折愈合過程中,H2S可以降低局部炎性細(xì)胞浸潤并抑制OB中的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用,促進(jìn)骨折的愈合。內(nèi)源性H2S在牙周韌帶細(xì)胞(Periodontal ligament cell,PDL)和人牙周膜干細(xì)胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)中

4、也有表達(dá),參與正畸力力學(xué)信號的傳導(dǎo),有助于牙周干細(xì)胞的成骨分化,對牙周組織和正畸牙齒移動中軟硬組織的改建發(fā)揮重要作用。有學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),H2S異常代謝與骨代謝缺陷有關(guān),提示如果能在動物體內(nèi)提供有效無毒的H2S供體,有可能治療因H2S缺乏而引起的骨質(zhì)疏松癥等疾病。機(jī)體各個系統(tǒng)及組織中內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生的作用及生理病理機(jī)制正在不斷揭示,隨著對外源性H2S的合成、供體的研究不斷深入,H2S有著廣闊的治療性應(yīng)用前景,使用外源性H2S或其供體

5、,在控制一些疾病的發(fā)生及發(fā)展方面正在發(fā)揮其積極的作用。
  ATP敏感鉀離子通道(ATP-sensitive potassiumchannel,KATP)是最早報道的H2S生物學(xué)效應(yīng)靶分子,H2S能通過與心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、腸胃平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元上的KATP作用,產(chǎn)生調(diào)節(jié)心肌收縮力、血管緊張度、胰島素分泌、腸胃平滑肌收縮、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等效應(yīng),并且H2S還能通過KATP產(chǎn)生抗炎、抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)KAT

6、P與機(jī)體骨的形成密切相關(guān),KATP影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化,調(diào)節(jié)OB的增殖,作為離子通道,KATP維持骨細(xì)胞的膜電位并可能參與骨細(xì)胞的機(jī)械敏感性及細(xì)胞間通訊。非興奮細(xì)胞OB也存在KATP通道,但外源性H2S是否通過效應(yīng)分子KATP通道影響OB的功能目前尚未見報道。
  本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)大鼠下頜骨原代成骨細(xì)胞(Primary osteoblast,POB)為研究對象,應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),首先檢測外源性H2

7、S是否通過其效應(yīng)分子KATP參與調(diào)節(jié)HG誘導(dǎo)的OB損傷,其次檢測外源性H2S通過KATP通道對高糖誘導(dǎo)的OB功能的影響,包括細(xì)胞增殖、凋亡、礦化的分析和成骨分化相關(guān)信號分子ALP、collaⅠ、Runx2及OSX基因的表達(dá),本研究目的在于觀察外源性H2S-KATP通道對OB分化過程中的表達(dá)變化及功能的影響,進(jìn)一步探求KATP在OB分化中的作用,并初步研究分析其作用機(jī)制,尋找能調(diào)控或干擾OB功能、加速受損OB修復(fù)的新方法,以期為外源性H2

8、S促進(jìn)糖尿病患者骨的修復(fù)重建提供一定的理論基礎(chǔ),為骨代謝病的防治提供新線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  方法:
  1、大鼠下頜骨POB的分離培養(yǎng)及鑒定
  在無菌條件下,取出大鼠乳鼠的下頜骨,采用酶消化法-組織塊法聯(lián)合培養(yǎng),從骨片中獲取原代細(xì)胞,待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后傳代。對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),繪制生長曲線。用堿性磷酸酶鈣鈷法和茜素紅染色法對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行OB生化特性鑒定。
  2、觀察硫化氫

9、及高糖干預(yù)后OB的KATP通道的表達(dá)變化
  選擇3-5代生長旺盛,性質(zhì)穩(wěn)定的成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組(1)對照(control)組:DMEM培養(yǎng)基(5.5mmol·L-1DMEM)處理OB,30min;(2)高糖(HG)組:HG(26.5mmol·L-1DMEM)處理OB30min;(3)硫化氫鈉(NaHS,為H2S的供體)組:NaHS(400μmol·L-1)處理成骨細(xì)胞30min,撤去,PBS洗2次,接著DMEM培

10、養(yǎng)基處理30min;(4)NaHS+HG組:NaHS作用OB30min,撤去,PBS洗2次,接著用HG處理30min;提取總蛋白和RNA,采用定量Western Blot和RT-PCR方法測定KATP的蛋白及基因的表達(dá)。
  3、檢測硫化氫及KATP通道在高糖介導(dǎo)下對OB的增殖、凋亡、礦化及成骨分化相關(guān)信號分子的表達(dá)變化
  選擇3-5代生長旺盛,性質(zhì)穩(wěn)定的成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組(1)control;(2)HG;

11、(3)NaHS;(4)NaHS+HG;(5)格列本脲(KATP通道阻斷劑glibenclamide,Gli)組:Gli(0.01μmol·L-1)作用成骨細(xì)胞30min,撤去,PBS洗2次,接著DMEM培養(yǎng)基處理30min;(6)Gli+NaHS+HG組:Gli作用成骨細(xì)胞30min,撤去,PBS洗2次,后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟與第(4)實(shí)驗(yàn)組相同;(7)吡拉地爾(KATP通道開放劑pinacidil,Pin)組:Pin(0.1μmol·L-1)作

12、用成骨細(xì)胞30min,撤去,PBS洗2次,接著DMEM培養(yǎng)基處理30min;(8)Pin+HG組:Pin作用成骨細(xì)胞30min,撤去,PBS洗2次,接著HG處理30min;(9)Pin+NaHS+HG:Pin作用成骨細(xì)胞30min,撤去,PBS洗2次,后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟與第(4)實(shí)驗(yàn)組相同;分別用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡,CCK8及EDU方法檢測細(xì)胞增殖,茜素紅染色分析檢測細(xì)胞礦化,并用RT-PCR的方法檢測成骨分化相關(guān)信號分子堿性磷酸酶(A

13、lkaline phosphatase,ALP),骨橋蛋白(osteopotin,OPN),Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcript factor2,Runx2),成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix,OSX)的表達(dá)變化。
  結(jié)果:
  1、成功分離、培養(yǎng)、鑒定POB。鏡下觀察,細(xì)胞呈三角形、紡錘形和多角形等多種形態(tài),傳代培養(yǎng)成骨細(xì)胞狀態(tài)良好,細(xì)胞長滿瓶底時,呈梭形或立方形,排列緊密。從細(xì)胞

14、生長曲線觀察,第2-3天開始快速生長,第7-8天達(dá)生長高峰,數(shù)目達(dá)到峰值后增長速度逐漸減慢,進(jìn)入平臺期細(xì)胞數(shù)量開始下降,細(xì)胞停止增殖并出現(xiàn)細(xì)胞調(diào)亡。經(jīng)堿性磷酸酶鈣鈷法染色和茜素紅染色鑒定陽性,細(xì)胞具有OB的特性。
  2、H2S減弱HG對OB的KATP通道蛋白及基因的抑制作用。免疫印跡分析表明,KATP表達(dá)在HG組有明顯的抑制作用,NaHS+HG組KATP表達(dá)明顯高于HG組(P<0.01),KATP通道蛋白的表達(dá)量在HG影響下減少

15、,而NaHS減弱HG對KATP的表達(dá)抑制。RT-PCR結(jié)果說明,KATP基因的表達(dá)量在HG影響下明顯減少,而NaHS減弱HG對KATP基因的表達(dá)抑制。
  3、H2S通過KATP通道調(diào)節(jié)HG抑制的OB增殖,凋亡。HG對OB增殖具有明顯的抑制作用,KATP阻斷劑Gli對OB增殖的抑制作用與HG對OB的增殖抑制作用類似,NaHS與KATP通道開放劑Pin的作用類似,對OB的增殖增加比較明顯,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)用Gli

16、阻斷KATP通道,凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01),而KATP開放劑Pin對細(xì)胞凋亡的影響與control相比無明顯影響,在NaHS和Pin加入后與HG相比,細(xì)胞凋亡明顯減少,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
  4、H2S通過KATP調(diào)節(jié)OB分化及骨形成相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化;H2S對HG誘導(dǎo)的OB礦化減少有抑制作用,但抑制作用與KATP通道無關(guān)。HG明顯抑制OB的ALP、OPN,Runx2和OSX基因表達(dá)(P

17、<0.01)。用NaHS處理,ALP的增強(qiáng)不明顯,但OPN,Runx2和OSX的表達(dá)與control相比明顯增強(qiáng),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HG對Runx2、OSX的抑制作用被NaHS明顯減弱(P<0.01),導(dǎo)致OB分化及骨形成相關(guān)基因表達(dá)增加。HG處理后的OB礦化量明顯降低(P<0.01),同時NaHS預(yù)處理對HG導(dǎo)致的OB礦化減少有抑制作用NaHS預(yù)處理能增加OB的礦化量,然而,Gli或Pin對OB礦化的與contal相比

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