硫化氫后處理激活線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀通道和PI3K-Akt保護(hù)缺血大鼠心肌.pdf

1、目的： 硫化氫是一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，可以在半胱氨酸代謝過(guò)程中通過(guò)心血管系統(tǒng)胱硫醚-γ-裂解酶的作用下內(nèi)源性合成。研究表明硫化氫預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心肌有確切的保護(hù)作用。硫化氫后處理對(duì)缺血再灌注心肌是否有保護(hù)作用，以及其保護(hù)作用的內(nèi)源性機(jī)制有待于研究。本實(shí)驗(yàn)用大鼠離體心臟Langendorff缺血再灌注模型和培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，從器官、細(xì)胞、線(xiàn)粒體、分子水平研究硫化氫后處理對(duì)缺血再灌注心肌的作用。本實(shí)驗(yàn)的目的：(1)探討再

2、灌注早期給予硫化氫處理是否能減輕心肌缺血再灌注損傷；(2)探討硫化氫后處理心肌保護(hù)作用機(jī)制是否與線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀通道開(kāi)放有關(guān)；(3)研究P13K/Akt/GSK3β信號(hào)通路是否參與了硫化氫和處理的心肌保護(hù)作用機(jī)制；(4)探討硫化氫后處理誘導(dǎo)線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀通道開(kāi)放和P13K/Akt/GSK3β激活對(duì)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)是否有調(diào)節(jié)作用。 方法： 1、再灌注早期硫化氫后處理保護(hù)心肌免受再灌注損傷 所有離

3、體灌注的大鼠心臟經(jīng)受30分鐘缺血和90分鐘再灌注。后處理方式：再灌注即刻給予4次15秒缺血或含硫氫化鈉的灌注液處理間隔15秒含氧灌注液灌注。48只大鼠隨機(jī)分入以下6組，每組8只：缺血/再灌注(CON)、缺血后處理組(Pcon)；0.1μmol/L硫氫化鈉后處理組(NP0.1)；1μmol/L硫氫化鈉后處理組(NP1)；10μmol/L，硫氫化鈉后處理組(NP10)；100μmol/L，硫氫化鈉后處理組(NP100)。觀(guān)察各組血流動(dòng)力學(xué)指

4、標(biāo)、冠脈漏出液肌酸激酶、乳酸脫氫酶釋放和心肌梗死面積變化。 2、硫化氫后處理中線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀通道的作用 灌注方案同實(shí)驗(yàn)一。大鼠隨機(jī)分為7組，每組8只：0.2％dimethy1 sulfoxide(DMSO)溶劑對(duì)照組(Vehicle)；缺血再灌注對(duì)照組(CON)；1μmol/L硫化氫后處理組(NP1)；100μmol/L 5-羥葵酸拮抗NP1組(5-HD+NP1)；10μmol/L格列本脲拮抗NP1組(Gli+NP

5、1)；100μmol/L 5-羥葵酸組(5-HD)；10μmol/L格列本脲組(Gli)。觀(guān)察各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、冠脈漏出液肌酸激酶、乳酸脫氫酶釋放和心肌梗死面積變化。 3、硫化氫后處理中PI3K-Akt-GSK3β信號(hào)通路的作用 缺血再灌注方案同實(shí)驗(yàn)一。大鼠隨機(jī)分入以下5組，每組8只：0.2％DMSO溶劑對(duì)照組(Vehicle)；缺血再灌注對(duì)照組(CON)；1μmol/L硫化氫后處理組(NP1)、15μmol/L的LY

6、294002拮抗NP1組(LY+NP1)；15μmol/L的LY294002溶于0.02％DMSO組(LY)觀(guān)察各組心臟心功能、酶學(xué)、心肌梗死面積指標(biāo)，免疫組化和Western blot檢測(cè)磷酸化Akt和磷酸化GSK3β的表達(dá)。 4、硫化氫后處理中線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道的作用 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)受2小時(shí)缺氧2小時(shí)復(fù)氧復(fù)制缺氧/復(fù)氧模型。同批培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分入以下6組：(CON)缺氧／復(fù)氧組；(NPl)1μmol/L硫

7、氫化鈉后處理組；(NPl+5-HD)1μmol/L硫氫化鈉后處理+100μmol/L的5羥葵酸組；(NP1+LY) 1μmol/L硫氫化鈉后處理+15μmol/L的LY294002組；(LY)15μmol/L的LY294002組；(5-HD)100μmol/L的5-HD組。檢測(cè)各組細(xì)胞存活率、線(xiàn)粒體游離鈣、線(xiàn)粒體活性氧、線(xiàn)粒體膜電位、線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換、線(xiàn)粒體胞漿細(xì)胞色素C含量和線(xiàn)粒體電鏡分析。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資

8、料數(shù)據(jù)用(-x±s)表示。SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較用單因素方差分析，SNK檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、硫化氫后處理保護(hù)大鼠心肌免受再灌注損傷 再灌注60和90分鐘，Peon(69±5,66±7mmHg)，NP0.1(65±6,63±5mmHg)，NP1(67±6,65+7 mmHg)，NP10(61±5，60±6mmHg)各組的LVDP分別顯著高于缺血再灌注CON組(48

9、±8，43±6 mmHg)(均P<0.05)；Peon心肌梗塞面積(21.7 ±6.2％)低于CON(47.6±5.3％，P<0.05)。與CON比較，0.1-10gμmol/L硫氫化鈉后處理各組劑量依賴(lài)性減少心肌梗塞面積(NP0.1，34.2 ±5.1％，NP1，23.4 ±4.6％,NP10，25.1 ±7.2％，P<0.05與CON組比較)，而100μmol/L NaHS未能減少梗死面積。與CON比較，Peon明顯抑制了冠脈漏出液

10、中CK、LDH的釋放(均P<0.05)；NP0.1、NPl、NP10也劑量依賴(lài)性抑制了CK、LDH的釋放(均P<0.05)。 2、硫化氫后處理開(kāi)放ATP敏感性鉀通道保護(hù)心肌 根據(jù)實(shí)驗(yàn)一量效關(guān)系結(jié)果，選擇1μmol/L的NaHS為后處理代表性硫化氫后處理劑量，進(jìn)一步研究鉀通道阻斷劑是否能拮抗硫氫化鈉的心肌保護(hù)作用。結(jié)果顯示，10μmol/L格列苯脲和100μmol／L的5-HD均拮抗了NP1組減少心肌梗塞面積的保護(hù)作用(G

11、li+NPl，46.5±8.6％；5-HD+NPl，42.0±10.3％，P<0.05與NPl組比較，23.4 ±4.6％)。再灌注早期給與10 μmol／L格列苯脲或100μmol／L 5-HD均能拮抗硫化氫后處理再灌注60、90分鐘提高LVDP的作用(均P

12、比較，NP1組心肌梗塞面積(23.4±7.2％)明顯小于CON(47.6±5.3％，P<0.05)；NP1明顯抑制冠脈漏出液CK，LDH的釋放(均P<0.05)。NP1組顯著提高了磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3β(Ser9)的表達(dá)(均P<0.05)。151μmol/L的LY294002拮抗了硫化氫后處理減少心肌梗塞面積的作用，LY+NP1組(44.5±6.7％)梗死面積高于NPl組(23.4±7.2％，P<0.05)。L

13、Y294002拮抗了NP1組限制心肌CK、LDH釋放的保護(hù)作用(均P<0.05)。同時(shí)LY+NP1組的磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3β(Ser9)的表達(dá)顯著低于NP1組(均P<0.05)。 4、硫化氫后處理激活A(yù)TP敏感性鉀通道和P13K-Atk-GSK-3β信號(hào) 最終抑制線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換缺氧復(fù)氧末NP1組心肌細(xì)胞存活率高于CON(49.1±3.8％vs 31.9±4.1％，P<0.05)；線(xiàn)粒體游離鈣濃

14、度低于CON(424.3±14.7 vs 712.8±18.4 nmol/mg．pro，P<0.05)；線(xiàn)粒體活性氧產(chǎn)生速率低于CON(8.1±0.6 vs 13.2±0.7 fluorescenceunits/sec．mg．pro，P<0.05)；線(xiàn)粒體膜電位TMRE熒光相對(duì)值高于CON(73.6±4.5％vs51.6±6.1％，P<0.05)；Calcein熒光相對(duì)值高CON(提示抑制了線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換)(61.7±7.5％Vs 3

15、9.4±5.2％，P<0.05)，增加了線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C的含量保存(p<0.05)，減少了胞漿細(xì)胞色素C的釋放(p<0.05)，保存了線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)完整。100μmol/L的5-HD完全拮抗了NP1組以上保護(hù)效果(均P<0.05)。15μmol/L的LY294002拮抗了NP1組在細(xì)胞存活率以及線(xiàn)粒體膜電位、MPTP方面、細(xì)胞色素C釋放的保護(hù)作用(均P<0.05)，而未能拮抗NP1組對(duì)線(xiàn)粒體鈣、活性氧的抑制作用。 結(jié)論：

16、 (1)硫化氫后處理能夠保護(hù)缺血再灌注大鼠心臟免受再灌注損傷。其保護(hù)作用體現(xiàn)在：抑制線(xiàn)粒體游離鈣超載和線(xiàn)粒體活性氧的產(chǎn)生，抑制線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換的發(fā)生，提高復(fù)氧心肌細(xì)胞膜電位，保護(hù)線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的完整，減少線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C的釋放。最終提高復(fù)氧細(xì)胞存活率，減少心肌梗塞面積，提高再灌注心肌收縮功能。 (2)硫化氫后處理心肌保護(hù)機(jī)制包括線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀通道的開(kāi)放。 (3)硫化氫后處理激活線(xiàn)粒體．ATP敏感性鉀通道開(kāi)放，抑制線(xiàn)