核因子-κB介導(dǎo)糖尿病性痛覺過敏的分子和表觀調(diào)控機制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病最常見也是最易致殘的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)生率根據(jù)診斷標準和檢測方法的不同，患病率在10％~96%不等（中國2型糖尿病防治指南2013版）。其最常見的類型是周圍神經(jīng)病變，其次為糖尿病自主神經(jīng)病變。周圍神經(jīng)病變常表現(xiàn)為遠端肢體對稱性的麻木感，部分患者會出現(xiàn)異常疼痛，包括自發(fā)痛、痛覺過敏（輕度刺激引起劇烈疼痛）和痛覺超敏（無害刺激如光照、觸摸時也能引起明顯疼痛）等，稱為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛。而自主神

2、經(jīng)病變主要影響心血管、胃腸及泌尿生殖系統(tǒng)功能。當累及上消化道時，常導(dǎo)致患者出現(xiàn)上腹痛或不適、惡心嘔吐、反酸燒心、餐后飽脹等一系列癥狀，同時具有胃部痛覺過敏現(xiàn)象，表現(xiàn)為胃對胃酸、炎癥或擴張等刺激的反應(yīng)性明顯增加。目前糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機理尚未完全闡明，亦缺乏有效的臨床治療手段，顯著影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量。進一步研究其機制，對于尋找有效的治療靶點非常重要。
　　第一部分：
　　1.研究目的
　　闡明核因子-κB在糖尿

3、病胃部痛覺過敏形成中的作用及相關(guān)機制，主要研究內(nèi)容包括：
　　(1)探討糖尿病大鼠是否存在胃部痛覺過敏及其相關(guān)電生理機制。
　　(2)探討CBS-H2S系統(tǒng)是否參與糖尿病大鼠胃部痛覺過敏的形成。
　　(3)探討NF-κB對CBS-H2S系統(tǒng)的調(diào)控作用及相關(guān)機制。
　　2.實驗方法
　　(1)選用雌性成年SD大鼠作為實驗動物，應(yīng)用STZ（65mg/kg）腹腔單次注射誘導(dǎo)糖尿病模型。應(yīng)用胃部球囊擴張及肌電圖分析

4、技術(shù)，檢測大鼠的胃部感覺。
　　(2)應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠胃特異性DRG神經(jīng)元的興奮性及硫化氫對胃特異性DRG神經(jīng)元興奮性的影響。
　　(3)應(yīng)用Real-time PCR和Western blotting方法檢測大鼠胃特異性DRG中NF-κB、硫化氫合成酶CBS、DNA甲基化相關(guān)酶的表達水平。
　　(4)應(yīng)用甲基化特異性 PCR( MSP)和亞硫酸氫鹽處理測序法（BSP）檢測大鼠胃特異性DRG神經(jīng)元中cbs基

5、因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。
　　(5)應(yīng)用免疫熒光染色法觀察NF-κB與CBS在胃特異性DRG神經(jīng)元上的表達情況。
　　(6)應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）法檢測大鼠胃特異性DRG中NF-κB與cbs基因啟動子區(qū)的結(jié)合度。
　　3.實驗結(jié)果
　　(1)STZ腹腔注射后2-6周糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的胃部痛覺過敏，第4-6周痛敏最為明顯。STZ注射后第4周，糖尿病大鼠胃特異性DRG神經(jīng)元興奮性明顯增加。
　　(2

6、)糖尿病大鼠胃特異性DRG中CBS表達增加。腹腔注射CBS抑制劑AOAA能夠緩解糖尿病大鼠胃部痛覺過敏，并呈劑量依賴性。腹腔注射AOAA能夠降低糖尿病大鼠胃特異性DRG神經(jīng)元的興奮性。H2S衍生劑NaHS能夠增加DRG神經(jīng)元興奮性。
　　(3)NF-κB與CBS共表達于大鼠胃特異性DRG神經(jīng)元中，糖尿病大鼠胃特異性DRG中NF-κB與cbs基因啟動子區(qū)結(jié)合度增加。腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC能夠下調(diào)糖尿病大鼠胃特異性DRG中C

7、BS的表達。糖尿病大鼠胃特異性DRG中cbs基因啟動子區(qū)明顯去甲基化，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a、3b表達下調(diào)。
　　4.小結(jié)
　　(1)糖尿病大鼠存在胃部痛覺過敏，并與胃特異性DRG神經(jīng)元興奮性增加有關(guān)；
　　(2)糖尿病狀態(tài)下，胃特異性DRG神經(jīng)元中CBS的表達上調(diào)，增加H2S的合成，致敏神經(jīng)元，參與糖尿病胃部痛覺過敏的形成；
　　(3)糖尿病狀態(tài)下，活化的NF-κB可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)CBS的表達；cbs基因啟動子

8、區(qū)去甲基化增強，使得NF-κB與cbs基因啟動子區(qū)的結(jié)合成為可能，并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　第二部分：
　　1.研究目的
　　闡明核因子-κB在糖尿病后肢痛覺過敏形成中的作用及相關(guān)機制，主要研究內(nèi)容包括：
　　(1)探討轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是否參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成。
　　(2)探討配體門控通道P2X3受體是否參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成。
　　(3)探討NF-κB對P2X3受體的調(diào)控作

9、用及相關(guān)機制。
　　2.實驗方法
　　(1)選用雌性成年SD大鼠作為實驗動物，應(yīng)用STZ（65mg/kg）腹腔單次注射誘導(dǎo)糖尿病模型。應(yīng)用Von frey filament(VFF)和熱刺激儀定量檢測大鼠的后肢痛覺閾值。
　　(2)應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠后肢特異性DRG神經(jīng)元ATP誘導(dǎo)的的電流密度。
　　(3)應(yīng)用Real-time PCR和Western blotting方法檢測大鼠后肢特異性DRG中NF

10、-κB、P2X3（及P2X1，P2X2）、DNA甲基化相關(guān)酶的表達水平。
　　(4)應(yīng)用甲基化特異性 PCR( MSP)和亞硫酸氫鹽處理測序法（BSP）檢測大鼠后肢特異性DRG神經(jīng)元中p2x3基因啟動子區(qū)的甲基化程度。
　　(5)應(yīng)用免疫熒光染色法觀察 NF-κB與 P2X3在后肢特異性 DRG神經(jīng)元上的表達情況；觀察攜帶GFP的慢病毒對后肢特異性 DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染情況。
　　(6)應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）法

11、檢測大鼠后肢特異性DRG中NF-κB與p2x3基因啟動子區(qū)的結(jié)合度。
　　3.實驗結(jié)果
　　(1)STZ腹腔注射后2周大鼠出現(xiàn)后肢機械痛敏及熱痛敏，并至少持續(xù)至第9周，第4-6周痛敏最為明顯。STZ注射后第4周，糖尿病大鼠后肢特異性DRG中NF-κB表達增加。腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC或鞘內(nèi)注射NF-κB siRNA慢病毒均能夠緩解糖尿病大鼠的后肢機械痛敏和熱痛敏。
　　(2)鞘內(nèi)注射P2受體拮抗劑suramin

12、或P2X3受體拮抗劑A-317491均能緩解糖尿病大鼠后肢痛覺過敏，并呈劑量依賴性。糖尿病大鼠后肢特異性DRG中P2X3受體表達增加（而非P2X1或P2X2）。糖尿病大鼠后肢特異性DRG神經(jīng)元ATP誘導(dǎo)的電流密度明顯增加。
　　(3) NF-κB與P2X3受體共表達于大鼠后肢特異性DRG神經(jīng)元中，糖尿病大鼠后肢特異性DRG中NF-κB與p2x3受體基因啟動子區(qū)結(jié)合度增加。鞘內(nèi)注射NF-κB siRNA慢病毒能夠下調(diào)糖尿病大鼠后肢特

13、異性DRG中P2X3受體的表達，并降低ATP誘導(dǎo)的電流密度。糖尿病大鼠后肢特異性DRG中p2x3受體基因啟動子區(qū)明顯去甲基化，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b表達下調(diào)。
　　4.小結(jié)
　　(1) NF-κB參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成；
　　(2)糖尿病狀態(tài)下，后肢特異性DRG神經(jīng)元中P2X3受體的表達及功能增加，參與糖尿病大鼠后肢痛覺過敏的形成；
　　(3)糖尿病狀態(tài)下，活化的NF-κB可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控P2X3受體的

14、表達；p2x3基因啟動子區(qū)域去甲基化，使得NF-κB與p2x3基因啟動子區(qū)的結(jié)合成為可能，并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　結(jié)論：
　　(1)糖尿病大鼠存在胃部痛覺過敏及后肢痛覺過敏，并分別與各自特異性DRG神經(jīng)元的敏化有關(guān)。
　　(2)NF-κB分別通過調(diào)控痛相關(guān)基因（cbs和p2x3）的表達，致敏胃特異性及后肢特異性DRG神經(jīng)元，導(dǎo)致胃部痛覺過敏及后肢痛覺過敏。
　　(3)DNA甲基化參與NF-κB對痛相關(guān)基因cb