腫瘤壞死因子TNF-a參與紅核痛覺信號通路調控的機制.pdf

1、目的：腦組織紅核（red nucleus，RN）基團腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）對于病理性疼痛的進展有十分重要的意義。本研究主要探討核因子（NF-κB）、胞外調節(jié)激酶（ERK）、p38促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）及c-Jun氨基端激酶（JNK）在TNF-α誘導的機械性疼痛中所扮演的角色，進而探討紅核腫瘤壞死因子TNF-a參與痛覺信號通路調控的機制。
　　方法：
　　

2、1.大鼠紅核插管術
　　將正常大鼠固定于腦立體定位儀上，參照大鼠腦定位圖譜確定：一側紅核，前囟后5.9mm；矢狀縫旁開1.0mm；顱表深6.9mm進行紅核插管，術后2天給紅核基團進行反復微量注射鼠源性重組TNF-α（每天20 ng，持續(xù)3d）干預，給藥3d后的第2d，大鼠對側腳掌誘導出疼痛，而同側未出現(xiàn)疼痛癥狀，且對側腳掌疼痛維持24h后消失。在同一紅核基團再次注射20ng TNF-α，30min內誘導出機械性疼痛，表明大鼠疼痛模

3、型成功。
　　2.行為學及痛覺異常的測定
　　在實驗前三天讓所有大鼠熟悉實驗環(huán)境，實驗開始后將其放在金屬網(wǎng)上蓋上有機玻璃罩，先適應20分鐘左右后，然后用標準化的von Frey尼龍絲刺激注射了TNF-a的大鼠紅核對側的腳掌外側腳趾及邊緣,使von Frey尼龍絲彎成S形或C形持續(xù)7秒左右后,觀察其反應，大鼠如果在測定時間內有迅速縮足或舔爪反應為陽性反應。同樣利用相同方法刺激未注射TNF-α大鼠，則無上述反應。
　　3.

4、大鼠給藥及免疫組化
　　建立好的模型大鼠用微量注射器通過紅核給藥，將NF-KB、ERK、P38MAPK及JNK的抑制劑分別注入核團后觀察大鼠誘發(fā)機械性疼痛起始和維持階段的行為學變化，同時通過免疫組化方法進一步測定腦組織NF-KB、ERK、P38MAPK及JNK的表達量。
　　4.統(tǒng)計分析：統(tǒng)計分析采用Sigmastat2.03軟件的Two way RM ANOVA（Bonferroni t-test）方法。雙因素方差分析用以

5、分析不同組別的藥物作用并對其進行多重比較分析，P<0.05被認為具有統(tǒng)計顯著性。
　　結果：免疫組化結果顯示：微量注射TNF-α后1h和4h其紅核組織中NF-κB、磷酸化ERK均顯著增加；但磷酸化JNK僅在微量注射TNF-α4h后才顯著增加，而1h后無顯著增加；與其相反，磷酸化p38 MAPK在微量注射TNF-α1h后增加而在4h后卻沒有明顯變化。通過行為學觀察證明，在對大鼠紅核基團注射TNF-α30min后，給予NF-κB抑制劑

6、PDTC，ERK抑制劑PD98059和p38 MAPK抑制劑SB203580能夠在30min便可抑制TNF-α誘導的機械性疼痛。然而，JNK抑制劑SP600125在給藥后1h才能阻止TNF-α誘導的機械性疼痛。在注射TNF-α4h后，再注射抑制劑PDTC、PD98059或 SP600125（不包括SB203580），能夠明顯抑制TNF-α誘導的機械性疼痛。
　　結論：TNF-α通過紅核基團誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛中扮演著重要的角色，N