心肌Junctophilin-2與SK2通道以及和RyRs相互作用的分子生物學(xué)研究.pdf

1、小電導(dǎo)-Ca2+-激活K+通道(small-conductance Ca2+-activated K+channels，SK，KCa2)幾乎存在于所有可興奮細胞的胞漿膜上，依賴于細胞內(nèi)的Ca2+進行激活。SK通道家族由SK1、SK2、SK3以及一個在結(jié)構(gòu)和功能上與SK通道相似的中電導(dǎo)-Ca2+-激活K+通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels，IK或稱SK4)組成。SK1

2、、SK2和SK3三個亞型在人類、小鼠和大鼠心肌細胞中均有表達，參與心肌細胞動作電位復(fù)極化的構(gòu)成。研究顯示SK1和SK2主要表達在心房，而敲除SK2通道的動物出現(xiàn)心房細胞復(fù)極化延長，增加房顫和房撲等快速性心律失常的易感性。因此，SK2通道可能與室上性快速性心律失常有關(guān)，可作為室上性快速性心律失常的治療靶點，但它的調(diào)控機制目前還不明確。
　　引起SK2通道開放的細胞內(nèi)Ca2+信號來源有兩條途徑:位于細胞膜上的電壓-門控Ca2+通道(v

3、oltage-gated Ca2+channels，VGCCs)及內(nèi)/肌質(zhì)網(wǎng)(endo/sarcoplasmic reticulum，ER/SR)膜上RyRs(ryanodine receptors)敏感的Ca2+釋放通道。已有研究報道指出心肌細胞膜的Cav1.3L型Ca2+通道通過α-actinin與SK2通道進行耦聯(lián)，實現(xiàn)對SK2通道的調(diào)控，這提示SK2通道可能不是直接和調(diào)控性的Ca2+通道有生理性相互作用。我們實驗室前期實驗證據(jù)已

4、顯示心肌細胞膜表面的SK2通道與SR RyR2受體通道有功能性耦聯(lián)，但它們二者之間耦聯(lián)的中間分子并不清楚。
　　本研究通過質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)的方法篩選心肌組織中與JP2相互作用的蛋白質(zhì)，采用心肌組織和轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行免疫共沉淀和GST pull-down實驗來驗證JP2與SK2通道、JP2與RyR2之間的相互作用，進一步制備不同片段GST-JP2原核表達質(zhì)粒來驗證JP2與SK2通道和RyR2發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域，并通過功

5、能性實驗檢測JP2敲減后對鈣瞬變(calcium transients)的影響，以及JP2敲減后心肌鈣相關(guān)蛋白的表達。
　　研究方法:
　　1.采用健康成年C57BL/6小鼠，體重20-25g，雌雄不拘。
　　2.心肌肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白的分離和檢測:用差速離心的方法提取成年C57BL/6小鼠心臟肌質(zhì)網(wǎng)小泡的膜蛋白。并用Western blot方法檢測膜蛋白中SK2、JP2和RyR2的蛋白，用心肌組織蛋白做陽性對照。

6、>　　3.質(zhì)譜分析:心肌肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白裂解液中加入JP2抗體或鼠源無關(guān)的抗-IgG抗體，再用proteinG-Sepharose捕獲制備免疫共沉淀復(fù)合物，進行電泳后，考馬斯亮藍染色，選擇有差異的目標蛋白條帶作為質(zhì)譜分析樣品，送北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部進行質(zhì)譜分析。
　　4.生物信息學(xué):根據(jù)文獻將蛋白質(zhì)篩選，用geneontology網(wǎng)站進行分類，并在String網(wǎng)站上查出它們之間的相互作用。
　　5.Western blot鑒定:將

7、制備的免疫共沉淀復(fù)合物進一步用特異性SK2和RyR2抗體進行檢測。
　　6.構(gòu)建原核表達載體:使用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切原核表達載體pGEX-4T-1，將JP2全長、氨基端片段JP2-N1(1-253)和JP2-N2(216-350)、羧基端片段JP2-C(340-696)插入，構(gòu)建融合基因pGEX-4T-1-GST-JP2、pGEX-4T-1-GST-JP2-N1(aa1-253)、pGEX-4T-1-GST-JP2-N2(

8、aa216-350)和pGEX-4T-1-GST-JP2-C(aa340-696)。并用雙酶切和測序方法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒。
　　7.GST融合蛋白的原核表達和純化:將已鑒定的GST、GST-JP2以及GST-JP2不同片段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化宿主菌E.Coli BL21，用IPTG26℃過夜誘導(dǎo)表達靶蛋白，并用GST.BindTM樹脂層析柱純化融合蛋白。
　　8.構(gòu)建pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP

9、質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染HEK293細胞:以pCMV6-entry-SK2和pCDNA3.1-JP2為模板，制備pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP質(zhì)粒，用雙酶切和測序方法鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒。按照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。
　　9.GST pull-down分析:將結(jié)合了GST融合蛋白的層析柱中加入心臟裂解液或HEK293細胞裂解液，過夜孵育后用谷胱甘肽elution buffer洗脫，并用SK

10、2或RyR2抗體進行檢測。
　　10.Co-IP法檢測體外JP2和SK2相互作用:將共轉(zhuǎn)染SK2和JP質(zhì)粒的HEK293細胞裂解液與抗體過夜孵育，再用proteinG-Sepharose制備免疫共沉淀復(fù)合物;再分別用抗SK2和抗JP2抗體進行檢測。
　　11.尾靜脈注射腺病毒:給健康成年C57BL/6小鼠尾靜脈注射總量為1×109PFU的攜帶陰性對照siRNA(Ad-NC)或JP2-siRNA(Ad-siJP2)的腺病毒。注

11、射后7天分離成年小鼠心肌細胞。
　　12Western blot的方法測定注射腺病毒成年小鼠心臟JP2蛋白表達，并檢測對SK2通道蛋白表達的影響。
　　13.鈣瞬變的測定:將Ad-NC和Ad-siJP2組成年小鼠心肌細胞懸液進行梯度復(fù)鈣，并加入終濃度為2μM的Fura-2/AM，用1HZ場刺激誘發(fā)鈣瞬變，采用IonOptix心肌細胞收縮及離子濃度同步測量系統(tǒng)測量鈣瞬變，數(shù)據(jù)采用美國IonOptix公司的IonWizard6.

12、6軟件進行分析。
　　14.Western blot的方法測定RyR2、Cav.1.2、NCX、SERCA2鈣處理相關(guān)蛋白的表達。
　　15.統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。以配對t檢驗或單因素方差分析(one-way AN OVA)進行統(tǒng)計學(xué)處理。統(tǒng)計分析以P＜0.05為有顯著性差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.Western blot檢測顯示肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白中有SK

13、2、JP2和RyR2三種蛋白的表達。
　　2.在心肌肌質(zhì)網(wǎng)小泡膜蛋白中加入JP2抗體（免疫共沉淀實驗組）或鼠源無關(guān)的抗-IgG抗體（陰性對照組）制備質(zhì)譜分析樣品，電泳后考馬斯亮藍染色，觀察對照組和實驗組的蛋白質(zhì)泳帶，選出13條差異目標條帶。質(zhì)譜分析后得到35013個與JP2可能有相互作用的蛋白質(zhì)，最終篩選出90個相關(guān)的蛋白質(zhì)，其中包括SK2和RyR2蛋白。通過信息分析學(xué)進一步對蛋白質(zhì)進行分類，并測定它們之間的相互作用。
　　

14、3.String網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示JP2和RyR2兩者的直系同源蛋白可以在其他物種中共表達，可以預(yù)測它們之間可能存在相互作用;由于目前只能同源模建出小鼠SK2的CaM區(qū)（序列為655-785），不能預(yù)測SK2和JP2之間是否有相互作用;但通過Western blot的方法用特異性SK2和RyR2抗體檢測到肌質(zhì)網(wǎng)小泡裂解液中JP2可以沉淀SK2和RyR2蛋白。
　　4.GST-JP2融合蛋白可以pull-down心肌組織裂解液中的SK

15、2，提示GST-JP2與心肌中SK2有相互作用，并且這種相互作用主要發(fā)生在JP2氨基末端的MORN區(qū)，尤其是GST-JP2-N1(aa1-253)片段作用明顯，而GST-JP2的羧基末端GST-JP2-C片段(aa340-696)可以和心肌組織裂解液中的RyR2結(jié)合;體外實驗結(jié)果顯示GST-JP2的MORN1區(qū)1-253片段可以和HEK293細胞裂解液中的SK2蛋白結(jié)合。
　　5.將HEK293細胞共轉(zhuǎn)染SK2和JP2質(zhì)粒，用特異

16、性JP2或SK2抗體孵育細胞蛋白裂解液進行Co-IP實驗，結(jié)果顯示SK2可以共沉淀JP2，JP2可以和SK2結(jié)合，提示體外JP2和SK2之間可能有相互作用。
　　6.成年小鼠尾靜脈注射陰性對照siRNA或JP2-siRNA的腺病毒，Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組(Ctrl-NT)和陰性對照組(Ad-NC)相比，Ad-siJP2組JP2表達減少到了47％和48％，而SK2通道蛋白表達無明顯變化。
　　7.成年小

17、鼠心肌細胞JP2敲減后，用IonOptix心肌細胞收縮及離子濃度同步測量系統(tǒng)測量鈣瞬變，與Ad-NC相比，Ad-siJP2組鈣瞬變的幅度顯著減少，鈣瞬變到達峰值50％的時間卻顯著增加，而細胞內(nèi)靜息Ca2+水平和鈣瞬變衰減50％的時間沒有顯著變化。使用Caffine測量RyR2依賴性肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲存水平，與陰性對照組相比，鈣瞬變的幅度亦顯著減少。因此，敲減成年小鼠心肌JP2的表達，會減少心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放。
　　8.用Wes