TNFR1-RIP1-RIP3信號(hào)通路在麥芽酚鋁致PC12細(xì)胞程序性壞死中的作用研究.pdf

1、目的：
　　1．探討麥芽酚鋁對(duì)PC12細(xì)胞TNFR1、RIP1及RIP3的影響。
　　2．通過分別干擾TNFR1、RIP1及RIP3，進(jìn)一步探討TNFR1、RIP1及RIP3在麥芽酚鋁致PC12細(xì)胞程序性壞死中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1．培養(yǎng)PC12細(xì)胞，用Z-VAD-FMK和Nec-1分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并用麥芽酚鋁染毒。分別設(shè)置正常對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組、200μM Al(mal)3組、Z-VAD-

2、FMK（20μM）組、Z-VAD-FMK+Al(mal)3組、Nec-1（60μM）組和Nec-1+Al(mal)3組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)：AO-EB染色觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力， Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和壞死率，qRT-PCR法檢測(cè)TNFR1、RIP1及RIP3 mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)TNFR1、RIP1及RIP3蛋白表達(dá)量。
　　2．采用siRN

3、A干擾TNFR1，Z-VAD-FMK和Nec-1處理細(xì)胞，麥芽酚鋁染毒。分別設(shè)置正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、200μM Al(mal)3組、TNFR1 siRNA組、TNFR1 siRNA+Al(mal)3組、 TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK組、 TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK+Al(mal)3組、 TNFR1 siRNA+Nec-1組和 TNFR1 siRNA+Nec-1+Al(mal)3組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后測(cè)

4、定各項(xiàng)指標(biāo)：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力， Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和壞死率，qRT-PCR法檢測(cè)TNFR1、RIP1及RIP3 mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)TNFR1、RIP1及RIP3蛋白表達(dá)量。
　　3．干擾RIP1方法、分組及檢測(cè)指標(biāo)同2。
　　4．干擾RIP3方法、分組及檢測(cè)指標(biāo)同2。
　　結(jié)果：
　　1．麥芽酚鋁對(duì)PC12細(xì)胞的影響：（1）AO-EB染色觀

5、察細(xì)胞凋亡和壞死情況的變化：未經(jīng)麥芽酚鋁處理的各組細(xì)胞狀態(tài)良好，染色質(zhì)基本呈均勻綠染；Al(mal)3組凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞明顯增多；Z-VAD-FMK+Al(mal)3組凋亡細(xì)胞減少，壞死細(xì)胞增多；Nec-1+Al(mal)3組壞死細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增多。（2）各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，各未染鋁組間細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各染鋁組的細(xì)胞活力均下降（P<0.05）。與Al(mal

6、)3組相比，抑制劑處理并染鋁組細(xì)胞活力明顯升高（P<0.05）。（3）各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，染鋁后各組細(xì)胞凋亡率均增加（P<0.05）， Al(mal)3組和Z-VAD-FMK+Al(mal)3組細(xì)胞壞死率均增加（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，Z-VAD-FMK+Al(mal)3組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），Nec-1+Al(mal)3組細(xì)胞壞死率明顯降低（P<0

7、.05）。（4）各組間 TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，各染鋁組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)增加（P<0.05）， Nec-1組TNFR1蛋白表達(dá)量略有下降（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，抑制劑處理并染鋁組TNFR1蛋白表達(dá)均下降（P<0.05）。與抑制劑處理組相比，相應(yīng)抑制劑處理并染鋁組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.05）。（5）各組間RIP1 m

8、RNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，Nec-1處理后 RIP1蛋白表達(dá)量明顯下降（P<0.05），未經(jīng)Nec-1處理的各染鋁組的RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，Z-VAD-FMK+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量增加（P<0.05），Nec-1+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量下降（P<0.05）。與抑制劑組相比，相應(yīng)抑制

9、劑處理并染鋁組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）。（6）各組間 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，Nec-1組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量下降（P<0.05），各染鋁組RIP3蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，Z-VAD-FMK+Al(mal)3組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量增加（P<0.05），Nec-1+Al(mal)3組RIP3 mRNA和

10、蛋白表達(dá)量略有下降（P<0.05）。與抑制劑處理組相比，相應(yīng)抑制劑并染鋁組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）。
　　2．TNFR1 siRNA干擾對(duì)麥芽酚鋁染毒PC12細(xì)胞的影響：（1）各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，染鋁后各組細(xì)胞活力均明顯下降（P<0.05）；與Al(mal)3組相比，凋亡、程序性壞死抑制劑處理后細(xì)胞活力增加（P<0.05）。與TNFR1siRNA組比較，干擾

11、并染鋁的各組細(xì)胞活力明顯下降（P<0.05）。（2）各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，干擾后各組中，除TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK組外的其余各組細(xì)胞凋亡率均增加（P<0.05），除 Nec-1+Al(mal)3外各染鋁組細(xì)胞壞死率增加（P<0.05）。與 Al(mal)3組相比，干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率增加、壞死率下降（P<0.05）。與TNFR1 siRNA組相比，抑制劑處理

12、后各組細(xì)胞壞死率均下降（P<0.05）。與 TNFR1 siRNA+Al(mal)3組相比， Z-VAD-FMK+Al(mal)3組細(xì)胞凋亡率下降，壞死率增加（P<0.05），Nec-1+Al(mal)3組細(xì)胞凋亡率明顯增加，壞死率下降（P<0.05）。（3）各組間 TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，TNFR1 siRNA干擾后各組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P<0.

13、05），TNFR1基因沉默效率達(dá)70％以上。與TNFR1 siRNA組相比，干擾后各染鋁組TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加。（4）各組間RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，干擾后各未染鋁組及Nec-1+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量均下降。與TNFR1 siRNA組相比，干擾后各未染鋁組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)下降，各染鋁組則表達(dá)增加（P<0.05）。與TNFR

14、1 siRNA+Al(mal)3組相比，干擾后Nec-1+Al(mal)3組RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)下降。（5）各組間RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，干擾后各組 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)均降低；與TNFR1 siRNA組相比，干擾后各染鋁組RIP3 mRNA表達(dá)水平明顯上升（P<0.05）， TNFR1 siRNA+Al(mal)3組RIP3蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。

15、　　3．RIP1 siRNA干擾對(duì)麥芽酚鋁染毒PC12細(xì)胞的影響：（1）各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，Al(mal)3處理后各組的細(xì)胞活力均明顯下降（P<0.05）；與Al(mal)3組相比，RIP1 siRNA干擾后染鋁組細(xì)胞活力有升高趨勢(shì)，經(jīng)抑制劑處理并染鋁的 PC12細(xì)胞活力明顯升高（P<0.05）。（2）各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，染鋁后各組細(xì)胞凋

16、亡率均增加(P<0.05），除 RIP1 siRNA+Nec-1+Al(mal)3組外各染鋁組細(xì)胞壞死率增加（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率均下降。與RIP1 siRNA組比，干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率均增加（P<0.05），RIP1 siRNA+Al(mal)3組細(xì)胞壞死率升高（P<0.05）。與RIP1 siRNA+Al(mal)3組相比，抑制劑處理并染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率均下降（P<0.

17、05）。（3）各組間 TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，各未染鋁組TNFR1 mRNA表達(dá)無明顯變化（P>0.05），各染鋁組TNFR1 mRNA表達(dá)基本一致，均明顯增高（P<0.05）；RIP1 siRNA干擾后TNFR1蛋白表達(dá)下降，其中Nec-1組下降明顯（P<0.05）。（4）各組間RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，干擾后各組RIP1

18、mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯下降（P<0.05），RIP1基因沉默效率達(dá)85%以上。（5）各組間 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，干擾后各組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量均下降（P<0.05）。與RIP1 siRNA組相比， RIP1siRNA+Nec-1組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯下降（P<0.05），干擾后各染鋁組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加（P<0.05）。
　　

19、4．RIP3 siRNA干擾對(duì)麥芽酚鋁染毒PC12細(xì)胞的影響：（1）各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，經(jīng)Al(mal)3處理后各組的細(xì)胞活力均明顯下降（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，干擾后各染鋁組細(xì)胞活力升高（P<0.05）。與RIP3 siRNA組比較，干擾后各染鋁組細(xì)胞活力下降（P<0.05）。與抑制劑處理組相比，相應(yīng)抑制劑并染鋁組細(xì)胞活力下降（P<0.05）。（2）各組間細(xì)胞凋亡率和壞死率

20、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，各染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率均顯著增加（P<0.05）。與 Al(mal)3組相比，干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率均上升、壞死率下降（P<0.05）。與RIP3 siRNA組相比，Z-VAD-FMK組細(xì)胞凋亡率下降（P<0.05），Nec-1組細(xì)胞壞死率下降（P<0.05），干擾后各染鋁組細(xì)胞凋亡率和壞死率增加（P<0.05）。與RIP3 siRNA+Al(mal)3組相比，抑制劑處理并染鋁組

21、細(xì)胞凋亡率無明顯變化，壞死率下降。（3）各組間TNFR1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與對(duì)照組相比，干擾后未染鋁的各組間 TNFR1蛋白表達(dá)量無明顯變化，干擾并經(jīng)Al(mal)3處理的各組TNFR1蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，干擾后各染鋁組TNFR1蛋白表達(dá)量均下降。（4）各組間RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與正常對(duì)照組相比，干擾后未染鋁的各組

22、和Nec-1+Al(mal)3組RIP1蛋白表達(dá)下降，余各染鋁組RIP1蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）。與Al(mal)3組相比，經(jīng)抑制劑和鋁處理后RIP1 mRNA和蛋白表達(dá)量下降，其中Nec-1+Al(mal)3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（5）各組間 RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與正常對(duì)照組相比，RIP3 siRNA干擾后各組RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降（P<0.05），RI