胃癌細(xì)胞SGC-7901中β3Gn-T8與轉(zhuǎn)錄因子c-Jun相關(guān)性初探.pdf

1、目的:β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(β3GnTs)家族是糖基轉(zhuǎn)移酶的重要成員。其中β1，3葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶8(β3Gn-T8)，又名β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶7(β3GalT7)，是本課題組首先在國際上克隆獲得的人類糖基轉(zhuǎn)移酶新基因。本論文通過生物信息學(xué)方法分析了β3Gn-T8上游調(diào)控序列啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)有多個(gè)c-Jun結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步闡明β3GnT8與c-jun的相關(guān)性，本研究以c-jun中等表達(dá)和β3Gn-T

2、8高表達(dá)的人胃癌SGC-7901細(xì)胞株為研究對象，探討胃癌SGC-7901細(xì)胞株中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun對糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 方法:
　　 1、應(yīng)用三種生物信息學(xué)軟件對β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，并構(gòu)建c-Jun基因的正義表達(dá)載體，經(jīng)酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒。
　　 2、根據(jù)預(yù)測結(jié)果構(gòu)建β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)系列截短體，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析β3Gn-T

3、8啟動(dòng)子區(qū)系列截短體的轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 3、設(shè)計(jì)并構(gòu)建4條針對c-Jun mRNA靶點(diǎn)的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA，同時(shí)設(shè)計(jì)shRNA無關(guān)序列作為陰性對照(negativecontrol，NC)，并構(gòu)建表達(dá)載體;以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察以最高轉(zhuǎn)染效率和最低細(xì)胞死亡率為原則，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，根據(jù)優(yōu)化的條件將pGPU6/GFP/Neo-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌SGC

4、-7901細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測四組pGPU6/GFP/Neo-shRNA對c-Jun基因表達(dá)的抑制作用，篩選出干擾效果最好的一組表達(dá)載體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1、生物信息學(xué)分析:AliBaba2.1、PATCH和TESS三種在線軟件預(yù)測結(jié)果分析β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)存在著c-Jun基因的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
　　 2、雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示

5、:c-Jun對β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄激活作用，其中啟動(dòng)子區(qū)—561/+8片段的轉(zhuǎn)錄活性最高，且對c-Jun呈劑量依賴性。
　　 3.pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建:靶向c-Jun mRNA的四個(gè)pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體經(jīng)酶切、測序鑒定，證實(shí)載體構(gòu)建成功;重組質(zhì)粒表達(dá)載體通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，RT-PCR和Wes

6、tern blot結(jié)果證實(shí)pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949對c-Jun表達(dá)抑制的效果最好。
　　 結(jié)論:
　　 1、生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)存在著轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
　　 2、雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示c-Jun對β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄激活作用，啟動(dòng)子區(qū)—561/+8片段的轉(zhuǎn)錄活性最高，且對c-Jun呈劑量依賴性。
　　 3.針對c-Jun基