毛細(xì)管在線富集技術(shù)在蛋白激酶活性檢測中的應(yīng)用.pdf

1、激酶催化蛋白磷酸化是一種將三磷酸腺苷(ATP)分子上γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白或多肽底物序列中含有絲氨酸、酪氨酸或是蘇氨酸殘基上的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，它在生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)中起到至關(guān)重要的作用，如細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)的生命過程（生長、分化、增殖、凋亡等）。在真核細(xì)胞中，用于編碼蛋白激酶的基因占總基因數(shù)的1-3％，而蛋白激酶的活性異常或是過表達(dá)與許多已知的疾病如炎癥、癌癥、糖尿病、老年癡呆癥等緊密相關(guān)。因此，通過測定特定激酶的活性不僅有

2、益于推動(dòng)基礎(chǔ)生命化學(xué)的研究進(jìn)程，而且對于理解與激酶相關(guān)疾病機(jī)理有重要意義，并對生物診斷治療和抗增生藥物研發(fā)具有重要作用。
　　傳統(tǒng)檢測蛋白激酶活性的方法主要是放射性方法和基于抗體-抗原特異性作用的免疫分析法，但這兩種方法存在著不足之處。其中放射性方法過程中涉及到對人類有害的放射性污染物，免疫分析方法的分析成本較高且缺少具有特異性識(shí)別的抗體。因此，新型激酶分析方法陸續(xù)被開發(fā)出來，如熒光方法、電化學(xué)方法、表面等離子體共振方法、質(zhì)譜分析

3、方法等。這些方法雖然各具一定的優(yōu)勢，但是也常常涉及到標(biāo)記、孵育、清洗、檢測等多步過程，耗時(shí)耗力。因此發(fā)展高效通用的激酶分析方法對于分析工作者依然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
　　綜合上述考慮，本文基于毛細(xì)管在線富集技術(shù)的優(yōu)異富集性能和毛細(xì)管電泳分析方法的高自動(dòng)化及高效分離能力，實(shí)現(xiàn)了對蛋白激酶活性及其對應(yīng)的激酶抑制劑的高靈敏度檢測和篩選。主要內(nèi)容如下:
　　1、基于非連續(xù)電解質(zhì)毛細(xì)管等速電泳技術(shù)(CITP)設(shè)計(jì)了一種在線間接檢測了蛋白激酶P

4、KA活性的電泳分析方法平臺(tái)。毛細(xì)管等速電泳不僅具有較高的分析效能，而且常常作為一種在線富集手段用以提高毛細(xì)管電泳分析方法的靈敏度。由于PKA激酶催化產(chǎn)生的微量磷酸化多肽經(jīng)由等速電泳技術(shù)在線富集之后被高效分離檢測，因此該方法的最低檢測限達(dá)到了12.5 mU/μL，相較傳統(tǒng)的CZE的最低檢測限50 mU/μL降低了約4倍，大大提高了該方法分析激酶活性時(shí)的檢測靈敏度。由于該方法結(jié)合了電泳分析方法的自動(dòng)化和程序化等優(yōu)點(diǎn)，所以在高通量分析激酶活性

5、或篩選激酶特定抑制劑有著巨大的應(yīng)用潛能。
　　2、基于毛細(xì)管在線等電聚焦技術(shù)(on-line CIEF)在線富集磷酸化的多肽并高靈敏高效分析PKA蛋白激酶活性。毛細(xì)管等電聚焦不僅具有較高的分辨率，而且常常被用于作為一種高效富集手段用以提高毛細(xì)管電泳方法的靈敏度。在該方法中，分析PKA蛋白激酶活性時(shí)的最低檢測限為1.25 mU/μL，較傳統(tǒng)CZE降低了約40倍，充分表明了on-line CIEF高靈敏度分析的特性。
　　3、基

6、于在線等電聚焦技術(shù)不僅具有較高的檢測靈敏度而且還具有較高的分離度，因此我們實(shí)現(xiàn)了多種激酶的同時(shí)分析及其抑制劑篩選并且檢測實(shí)際細(xì)胞裂解液中激酶的活性。其中對PKA和CDK1兩種激酶各自特異性抑制劑H-89、Ro-3306的抑制活性進(jìn)行了評估，其IC50值分別為37.0 nM、35.9 nM。實(shí)驗(yàn)表明，on-lineCIEF方法平臺(tái)不僅可以實(shí)現(xiàn)多種激酶活性的同時(shí)分析及其特定抑制劑的高效篩選，而且還可以用于檢測實(shí)際樣品細(xì)胞裂解液中PKA激酶的