生物標(biāo)志物的毛細(xì)管電泳在線(xiàn)富集技術(shù)及應(yīng)用研究.pdf

1、由于環(huán)境污染或身體的自然老化，人體內(nèi)會(huì)含有過(guò)量的活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)，這些ROS會(huì)損傷DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子，破壞機(jī)體正常生理活動(dòng)，而DNA中鳥(niǎo)嘌呤最易被羥基自由基和單線(xiàn)態(tài)氧等這些ROS所攻擊，使其C-8位發(fā)生羥化而生成8-羥基-2'-脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷(8-OHdG)，該產(chǎn)物是DNA氧化損傷的主要代謝物質(zhì)。近些年，檢測(cè)人體代謝物中8-OHdG最普遍的方法主要是高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法

2、(HPLC/EC)、氣相色譜-質(zhì)譜法方法(GC/MS)、液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法等(HPLC/MS)，這些方法檢測(cè)步驟繁多，且使用的儀器價(jià)格昂貴，難以在普通實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。而毛細(xì)管電泳在線(xiàn)富集技術(shù)在節(jié)省分析時(shí)間的同時(shí)，能夠使檢測(cè)靈敏度大大提高。因此，本文選取典型的生物標(biāo)志物8-OHdG和典型的氨基酸，建立了8-OHdG和氨基酸的毛細(xì)管電泳在線(xiàn)富集方法。主要有以下四個(gè)部分：
　　第1章：緒論部分。首先介紹了毛細(xì)管電泳(CE)的基礎(chǔ)理論和毛細(xì)

3、管電泳在線(xiàn)富集技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r；其次較全面的介紹了8-羥基-2'-脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷(8-OHdG)的產(chǎn)生、研究的意義及檢測(cè)方法；最后簡(jiǎn)述了本論文的研究目的和內(nèi)容。
　　第2章：優(yōu)化比較十二烷基硫酸鈉(SDS)和脫氧膽酸鈉(SDC)作為膠束對(duì)8-OHdG的掃集效果。通過(guò)對(duì)比SDS-硼砂緩沖溶液和SDC-硼砂緩沖溶液下富集條件，發(fā)現(xiàn)SDS對(duì)8-OHdG掃集效果比SDC對(duì)其的掃集效果好。選擇SDS-硼砂緩沖液體系進(jìn)行條件優(yōu)化：分離電壓10K

4、V，緩沖溶液為30mmol/L硼砂和80mmol/L SDS，8-OHdG和dG的最佳進(jìn)樣時(shí)間為90s。利用SDS富集8-OHdG，其靈敏度比區(qū)帶電泳法提高了34倍，最低檢測(cè)限(LOD)為490nmol/L。但由于尿樣中8-OHdG含量低，此方法靈敏度沒(méi)有達(dá)到檢測(cè)要求，而且該方法不能將尿樣中的8-OHdG完全分離。因此需進(jìn)一步提高富集方法的靈敏度已達(dá)到尿樣檢測(cè)水平。
　　第3章：納米金代替SDS作為膠束輔助毛細(xì)管電泳檢測(cè)尿液中8-

5、OHdG。研究工作表明，通過(guò)分析物與納米金之間的相互作用，分析物能夠被富集，其靈敏度比區(qū)帶電泳法提高了136倍，最低檢測(cè)限(LOD)為120nmol/L。結(jié)合固相萃取技術(shù)，在最佳的毛細(xì)管電泳條件下，可檢測(cè)到乳腺癌患者尿樣中8-OHdG的含量。但由于樣品預(yù)處理步驟繁瑣，因此下一步研究重點(diǎn)是省去預(yù)處理步驟，建立檢測(cè)靈敏度更高、更為高效的檢測(cè)方法。
　　第4章：研究納米金與表面活性劑共同作用對(duì)8-OHdG富集影響，通過(guò)在合成過(guò)程中加入不

6、同HAuCl4溶液的體積，合成出一系列粒徑不同納米金溶液。經(jīng)分析，納米金與表面活性劑結(jié)合對(duì)8-OHdG有很好的富集效果。此方法可檢測(cè)未經(jīng)樣品預(yù)處理的健康人尿樣和癌癥患者尿樣中的8-OHdG含量，其靈敏度比區(qū)帶電泳法提高了350倍，此法最低檢測(cè)限(LOD)為39nmol/L。
　　第5章：建立了毛細(xì)管電泳移動(dòng)反應(yīng)界面法富集苯丙氨酸和色氨酸。其富集的最優(yōu)條件：背景緩沖液為50mmol/L，pH2.3甲酸，樣品緩沖液為50mmol/L，

7、pH9.8的甲酸銨-氨水，壓力進(jìn)樣50mbar，進(jìn)樣時(shí)間140s，工作電壓15KV。此方法對(duì)色氨酸和苯丙氨酸檢測(cè)限分別為16nmol/L和64nmol/L，檢測(cè)靈敏度比區(qū)帶電泳法分別提高了144倍和83倍。此方法可用于癌癥尿樣的檢測(cè)，能有效排除尿液中其他物質(zhì)對(duì)二者的干擾。由于相關(guān)疾病的代謝產(chǎn)物可能含有一些特征的氨基酸或其他兩性物質(zhì)，但僅利用毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)，對(duì)于組分的定性會(huì)比較困難，因此本工作的下一步研究重點(diǎn)，是利用CE-MS結(jié)合移動(dòng)