白木香MAPK3基因的克隆及其表達(dá)初探.pdf

1、MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)等多種信號(hào)傳遞途徑中起著十分重要的作用，它負(fù)責(zé)外來(lái)信號(hào)的接收傳遞和放大，從而啟動(dòng)或調(diào)控基因的表達(dá)。珍稀瀕危植物白木香是國(guó)產(chǎn)沉香的重要來(lái)源，健康白木香樹(shù)只有受到外界傷害后才能形成沉香類物質(zhì)。前期研究中，我們從白木香中鑒定了一個(gè)顯著受傷害誘導(dǎo)表達(dá)的倍半萜合酶基因ASS1，并初步鑒定了一系列在傷害反應(yīng)中與ASS1協(xié)同表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，其中包括MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。<

2、br>　　本論文在此基礎(chǔ)上，對(duì)AsMAPK3基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析:
　　1.利用RT-PCR和RACE的方法克隆到白木香AsMAPK3基因的全長(zhǎng)cDNA序列，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1110 bp，編碼369個(gè)氨基酸?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)進(jìn)化分析顯示，本研究獲得MAPK3基因與甜瓜的的MAPK3基因形成一個(gè)小的進(jìn)化枝。預(yù)測(cè)分析顯示AsMAPK3為親水性蛋白且為不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為41.15，等電點(diǎn)pI5.42，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，AsM

3、APK3主要集中在細(xì)胞核上。
　　2.以白木香根、莖、葉為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)AsMAPK3基因的組織表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，AsMAPK3在葉子中的表達(dá)量最高，其次是莖，花中的表達(dá)量最低。對(duì)白木香的懸浮細(xì)胞進(jìn)行茉莉酸甲酯和水楊酸兩種化學(xué)傷害處理，研究在傷害脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，傷害信號(hào)可以調(diào)控AsMAPK3基因表達(dá)，在傷害處理24 h內(nèi)，基因的表達(dá)量有提高，隨后均有明顯降低。基因在不同傷害處理下表達(dá)量有所不同。
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4、.利用基因槍法對(duì)AsMAPK3的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，結(jié)果顯示AsMAPK3在洋蔥表皮細(xì)胞中定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核。
　　4.構(gòu)建pET-28a-AsMAPK3的原核表達(dá)載體，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的溫度、轉(zhuǎn)速以及IPTG的濃度摸索融合蛋白的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件。結(jié)果顯示，在37℃下，0.4 mM IPTG誘導(dǎo)4h，成功誘導(dǎo)出目的融合蛋白。
　　本論文的結(jié)果將為進(jìn)一步研究AsMAPK3在傷害信號(hào)誘導(dǎo)沉香倍半萜合成中的功能及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。