東亞三角渦蟲(chóng)Djtry基因的表達(dá)、功能及酶活測(cè)定.pdf

1、山東理工大學(xué)山東理工大學(xué)山東理工大學(xué)山東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文東亞三角渦蟲(chóng)東亞三角渦蟲(chóng)DjtryDjtryDjtryDjtry基因的表達(dá)、功能及基因的表達(dá)、功能及酶活測(cè)定酶活測(cè)定ExpressionExpressionExpressionExpressionfunctionalfunctionalfunctionalfunctionalanalysisanalysisanalysisanalysisofofofofDjtryDjtryDj

2、tryDjtryenzymeenzymeenzymeenzymeactivityactivityactivityactivitydetectiondetectiondetectiondetectionfromfromfromfromplanarianplanarianplanarianplanarianDugesiaDugesiaDugesiaDugesiajaponicajaponicajaponicajaponica研究生：周魯明周

3、魯明指導(dǎo)教師：趙博生趙博生教授教授申請(qǐng)學(xué)位門(mén)類(lèi)級(jí)別：理學(xué)碩士學(xué)碩士學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：分子細(xì)胞生物學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)論文完成日期：20122012年4月1515日單位代碼：10433104331043310433學(xué)號(hào)：Y0906205Y0906205Y0906205Y0906205分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：山東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要I摘要東亞三角渦蟲(chóng)(Dugesiajaponica)是扁形動(dòng)物門(mén)的代表動(dòng)物

4、，首次出現(xiàn)了兩側(cè)對(duì)稱(chēng)和中胚層，具有極強(qiáng)的身體可塑性和再生能力，已經(jīng)成為研究動(dòng)物進(jìn)化、胚胎發(fā)育及再生的重要模式動(dòng)物。胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物體中，并行使多種功能，包括食物消化、血淋巴凝結(jié)、抗菌活性、黑色素合成以及免疫信號(hào)通路激活等，具有典型的His(H)、Asp(D)和Ser(S)催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。從東亞三角渦蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中獲得編號(hào)為1218271的cDNA克隆，序列全長(zhǎng)706bp，含有一個(gè)609bp的最大開(kāi)放閱讀框(F)編碼

5、有203個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，推測(cè)其分子量約為22.6KDa。序列經(jīng)NCBIBLASTP程序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因具有完整編碼框的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(TrypsinlikeserineproteaseTryp_SPc)，將其命名為Djtry，另外其胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Tryp_SPcdomain)中含有不完全保守的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，其中第一位的His被Lys取代，故我們推測(cè)Djtry為絲氨酸蛋白酶家族同系物。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Dj

6、try是一種原始的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。我們利用Nthern雜交的方法，對(duì)Djtry基因是否在東亞三角渦蟲(chóng)中存在和大小進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)為單一條帶，且大小約為700bp，與我們得到的cDNA大小一致。利用整體原位雜交檢測(cè)整體和再生的渦蟲(chóng)以及渦蟲(chóng)各時(shí)期的胚胎發(fā)現(xiàn)，整體和再生的渦蟲(chóng)中，Djtry均在腸組織中特異性表達(dá)，而在渦蟲(chóng)胚胎發(fā)育各階段，Djtry也伴隨著腸的形成而表達(dá)，是一種腸的分子標(biāo)記。利用RealtimePCR檢測(cè)經(jīng)大

7、腸桿菌和食物刺激之后不同時(shí)間點(diǎn)Djtry在渦蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)變化，分析Djtry可能發(fā)揮的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)細(xì)菌攻擊之后Djtry的表達(dá)量上升而食物刺激后表達(dá)量相對(duì)平穩(wěn)，因此我們推斷Djtry可能參與渦蟲(chóng)的先天免疫反應(yīng)，抵御外界細(xì)菌的侵入。為了研究這種突變型的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶是否也具有胰蛋白酶的活性，我們通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Djtry以包涵體的形式大量表達(dá)，經(jīng)過(guò)對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行變性、純化、復(fù)性以及Wes